髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞毒性的体外研究
摘要：目的：对三氧化矿物凝聚体(MTA)、Z350纳米复合树脂、银汞合金3种常用髓腔穿孔修复材料对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)毒性进行体外比较研究。
方法：采用甲基噻唑基四唑(MTT)法研究3种材料对HPDLF增殖的影响，并采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法研究材料对细胞碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)mRNA表达的影响。
关键词：髓腔穿孔穿孔修复材料人牙周膜成纤维细胞细胞毒性
【中图分类号】R4【文献标识码】B【文章编号】1671-8801(2013)11-0134-02
髓腔穿孔是指髓室或根管与牙周组织非生理性的通道。其临床危害性极为严重，若不及时修复或修复方法不当，可显著影响治疗效果，最终可能导致患牙的拔除。影响髓腔穿孔修复效果的因素，除了穿孔本身状况和修复方法外，修复材料的选择尤为重要。
1材料和方法
1.1实验分组及浸提液的制备。实验分为4组，A组为MTA组，B组为Z350组，C组为银汞合金组，D组为对照组(含20%小牛血清的DMEM培养基)。前3组为实验组，按照使用说明制备成直径为5.0mm，高为2.5mm的圆柱体，表面不经过打磨抛光程序，紫外线消毒30min，将消毒后的材料浸入含20%小牛血清的DMEM培养基中，使标本的表面积与培养基的体积比为0.6cm2 middot；mL-1。将实验组和对照组置于37℃、5%CO2、95%O2、100%湿度孵箱7d后用于实验。
1.2实验细胞。将四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供的人牙周膜成纤维细胞传代至第6代备用。
1.3方法。
1.3.1细胞增殖的测定。将第6代HPDLF用胰酶消化后以密度为每毫升2times；104个接种于3块96孔板中，每孔200mu；L，培养24h，弃液。实验组每孔加入200mu；L浸提液，每4孔为1组，对照组加培养基，隔天更换药物及培养基，培养1、3、5d后各取1板，采用MTT法检测光密度值(A值)。按照公式计算细胞相对增殖率，RGR=A实验组/A对照组times；100%。按RGR范围进行毒性分级：①RGRge；100%，毒性级为0级；②75%le；RGRle；99%，毒性级为1级；③50%le；RGRle；74%，毒性级为2级；④25%le；RGRle；49%，毒性级为3级；⑤1%le；RGRle；24%，毒性级为4级；⑥RGR=0%，毒性级为5级。毒性级越大，毒性越大。
1.3.2实时荧光定量。PCR检测ALPmRNA和OC mRNA的表达水平 将第6代HPDLF胰酶消化后以密度为每毫升1times；105个接种于3块6孔板中，每孔2 mL，在含5%CO2、37 ℃下培养24 h，弃液。实验组每孔加入2mL浸提液，每4孔1组，对照组加培养基， 隔天更换药物及培养基。培养5 d后，弃去培养液，提取细胞总RNA，并作琼脂糖凝胶电泳。将提取的总RNA逆转录合成cDNA，扩增目的基因，最后实时荧光定量PCR扩增目的基因。荧光定量RCR的反应体系共30 mu；L，包括：10times；缓冲液3mu；L，dNTP 0.36 mu；L(25 mmolmiddot；L-1)，MgCl2 3mu；L，上游引物和下游引物各1 mu；L(10 mu；molmiddot；L-1)，染料(10 mu；molmiddot；L-1)1 mu；L，Taq聚合酶0.3mu；L，ddH2O 15.34 mu；L，cDNA 5 mu；L。
1.4统计学方法。应用SPSS12.0统计软件对MTT法结果进行单因素方差分析；应用REST专业软件对荧光定量PCR结果的Ct值进行分析，P<0.05为显著性标准，即为差异有统计学意义。
2结果
2.13种材料对HPDLF增殖的影响。3种材料与HPDLF共同培养1、3、5 d后，材料浸提液对细胞的增殖都有一定的影响(表1)。银汞合金组毒性级均为3级，有中度细胞毒性，与Z350组、MTA组和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Z350组毒性级为1级，基本没有细胞毒性，与其他3组相比差异有统计学意义(P<0.05)。MTA组细胞增殖良好，与Z350组和银汞合金组相比差异有统计学意义(P<0.05)。培养1、3、5 d后，MTA组与对照组相比，差异均无统计学意义。
2.23种材料对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达水平的影响。ALP和OC基因产物的扩增产物电泳结果在凝胶成像系统中进行观察，在148 bp处可见目的基因ALP mRNA条带，130 bp处可见目的基因OC mRNA条带，141 bp处可见GAPDH对照条带。
3讨论
髓腔穿孔修复后，修复材料的细胞毒性直接影响穿孔的预后。髓腔穿孔修复材料直接与牙周组织持续接触，一方面通过组织液长期对修复材料的浸提作用对牙周组织产生影响；另一方面材料直接刺激牙周组织，影响细胞附着、形态及增殖，影响牙槽骨的重建。因此，髓腔穿孔修复材料应具有良好的生物相容性，并且能促进牙周组织再生。由于临床修复髓腔穿孔时，材料直接接触穿孔处牙周膜组织，因而本实验选用原代培养的HPDLF作为细胞毒性实验的目标细胞，以能更接近口内实际情况。
本研究发现，MTA能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达，促进细胞向成骨样细胞分化；而Z350能促进细胞ALP mRNA的表达，对细胞OC mRNA的表达抑制作用不大；银汞合金对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制最强。Bonson等体外检测MTA对牙周膜成纤维细胞的影响，结果表明细胞在与MTA接触培养后均能表达与骨修复及骨质再矿化相关的基因，尤其是能提高ALP的表达，与本实验的研究结果一致。, 百拇医药(王立家)
方法：采用甲基噻唑基四唑(MTT)法研究3种材料对HPDLF增殖的影响，并采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)法研究材料对细胞碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)mRNA表达的影响。
关键词：髓腔穿孔穿孔修复材料人牙周膜成纤维细胞细胞毒性
【中图分类号】R4【文献标识码】B【文章编号】1671-8801(2013)11-0134-02
髓腔穿孔是指髓室或根管与牙周组织非生理性的通道。其临床危害性极为严重，若不及时修复或修复方法不当，可显著影响治疗效果，最终可能导致患牙的拔除。影响髓腔穿孔修复效果的因素，除了穿孔本身状况和修复方法外，修复材料的选择尤为重要。
1材料和方法
1.1实验分组及浸提液的制备。实验分为4组，A组为MTA组，B组为Z350组，C组为银汞合金组，D组为对照组(含20%小牛血清的DMEM培养基)。前3组为实验组，按照使用说明制备成直径为5.0mm，高为2.5mm的圆柱体，表面不经过打磨抛光程序，紫外线消毒30min，将消毒后的材料浸入含20%小牛血清的DMEM培养基中，使标本的表面积与培养基的体积比为0.6cm2 middot；mL-1。将实验组和对照组置于37℃、5%CO2、95%O2、100%湿度孵箱7d后用于实验。
1.2实验细胞。将四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供的人牙周膜成纤维细胞传代至第6代备用。
1.3方法。
1.3.1细胞增殖的测定。将第6代HPDLF用胰酶消化后以密度为每毫升2times；104个接种于3块96孔板中，每孔200mu；L，培养24h，弃液。实验组每孔加入200mu；L浸提液，每4孔为1组，对照组加培养基，隔天更换药物及培养基，培养1、3、5d后各取1板，采用MTT法检测光密度值(A值)。按照公式计算细胞相对增殖率，RGR=A实验组/A对照组times；100%。按RGR范围进行毒性分级：①RGRge；100%，毒性级为0级；②75%le；RGRle；99%，毒性级为1级；③50%le；RGRle；74%，毒性级为2级；④25%le；RGRle；49%，毒性级为3级；⑤1%le；RGRle；24%，毒性级为4级；⑥RGR=0%，毒性级为5级。毒性级越大，毒性越大。
1.3.2实时荧光定量。PCR检测ALPmRNA和OC mRNA的表达水平 将第6代HPDLF胰酶消化后以密度为每毫升1times；105个接种于3块6孔板中，每孔2 mL，在含5%CO2、37 ℃下培养24 h，弃液。实验组每孔加入2mL浸提液，每4孔1组，对照组加培养基， 隔天更换药物及培养基。培养5 d后，弃去培养液，提取细胞总RNA，并作琼脂糖凝胶电泳。将提取的总RNA逆转录合成cDNA，扩增目的基因，最后实时荧光定量PCR扩增目的基因。荧光定量RCR的反应体系共30 mu；L，包括：10times；缓冲液3mu；L，dNTP 0.36 mu；L(25 mmolmiddot；L-1)，MgCl2 3mu；L，上游引物和下游引物各1 mu；L(10 mu；molmiddot；L-1)，染料(10 mu；molmiddot；L-1)1 mu；L，Taq聚合酶0.3mu；L，ddH2O 15.34 mu；L，cDNA 5 mu；L。
1.4统计学方法。应用SPSS12.0统计软件对MTT法结果进行单因素方差分析；应用REST专业软件对荧光定量PCR结果的Ct值进行分析，P<0.05为显著性标准，即为差异有统计学意义。
2结果
2.13种材料对HPDLF增殖的影响。3种材料与HPDLF共同培养1、3、5 d后，材料浸提液对细胞的增殖都有一定的影响(表1)。银汞合金组毒性级均为3级，有中度细胞毒性，与Z350组、MTA组和对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。Z350组毒性级为1级，基本没有细胞毒性，与其他3组相比差异有统计学意义(P<0.05)。MTA组细胞增殖良好，与Z350组和银汞合金组相比差异有统计学意义(P<0.05)。培养1、3、5 d后，MTA组与对照组相比，差异均无统计学意义。
2.23种材料对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达水平的影响。ALP和OC基因产物的扩增产物电泳结果在凝胶成像系统中进行观察，在148 bp处可见目的基因ALP mRNA条带，130 bp处可见目的基因OC mRNA条带，141 bp处可见GAPDH对照条带。
3讨论
髓腔穿孔修复后，修复材料的细胞毒性直接影响穿孔的预后。髓腔穿孔修复材料直接与牙周组织持续接触，一方面通过组织液长期对修复材料的浸提作用对牙周组织产生影响；另一方面材料直接刺激牙周组织，影响细胞附着、形态及增殖，影响牙槽骨的重建。因此，髓腔穿孔修复材料应具有良好的生物相容性，并且能促进牙周组织再生。由于临床修复髓腔穿孔时，材料直接接触穿孔处牙周膜组织，因而本实验选用原代培养的HPDLF作为细胞毒性实验的目标细胞，以能更接近口内实际情况。
本研究发现，MTA能上调HPDLF中ALP mRNA和OC mRNA的表达，促进细胞向成骨样细胞分化；而Z350能促进细胞ALP mRNA的表达，对细胞OC mRNA的表达抑制作用不大；银汞合金对细胞ALP mRNA和OC mRNA表达的抑制最强。Bonson等体外检测MTA对牙周膜成纤维细胞的影响，结果表明细胞在与MTA接触培养后均能表达与骨修复及骨质再矿化相关的基因，尤其是能提高ALP的表达，与本实验的研究结果一致。, 百拇医药(王立家)