姜越,张宇林，董盈妹,严花,赵霞

    (1.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029；2.南京中医药大学中医儿科学研究所，江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023)

    哮喘是儿童时期常见的慢性疾病之一,以慢性气道炎症和气道高反应性为主要临床特点[1]。目前全球哮喘患者有3亿左右,其中儿童约占三分之一,我国是哮喘病死亡率较高的国家。我国完成的第3次儿童哮喘流行病学研究显示,我国儿童哮喘的患病率呈逐年增长的趋势[2]。

    吸入糖皮质激素等是西医防治哮喘的主要手段[3]。有研究表明,糖皮质激素长期使用给哮喘患者带来的副作用相比安慰剂而言要明显很多,而且还存在对其不敏感的难治型患者[4-5]。中医药防治哮喘在多年临床应用中获得广泛认可,固本防哮饮是我国著名中医儿科专家江育仁教授的经验方,临床研究表明其防治哮喘疗效突出[6]。课题组前期研究证实,固本防哮饮可有效减轻哮喘缓解期小鼠气道炎症[7],降低气道高反应性,改善小鼠肺功能[8]。

    近年来研究表明,在哮喘复杂的发病机制中,上皮损伤因素是不可忽视的诱因之一,哮喘患者气道上皮屏障完整性受损已被证明确实存在,即“缺陷上皮”假说[9]。从修复哮喘患者受损气道上皮屏障功能方面探讨固本防哮饮防治哮喘的作用机制十分必要,故本次实验通过研究固本防哮饮对哮喘缓解期小鼠气道上皮紧密连接蛋白和CCSP的作用,探讨固本防哮饮对气道上皮屏障完整性的修复作用及其防治哮喘的可能机制。

    1 材料

    1.1 动物

    SPF级雌性Balb/c小鼠36只,4～6周龄,体质量16～18 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,本研究经由南京中医药大学动物伦理委员会批准,伦理号:202012A054。

    1.2 药物

    孟鲁司特钠片:10 mg·片-1,购自杭州默沙东药业股份有限公司,批号:K004567。固本防哮饮:炙黄芪15 g，党参10 g，白术10 g，茯苓10 g，煅牡蛎15 g，蝉蜕6 g，陈皮6 g，防风3 g，辛夷6 g，五味子6 g，生甘草3 g,以上11味药材购自江苏省中医院。药物浸泡于10倍量冷水中30 min,煎30 min后滤出;第2煎取8倍量水煎30 min后滤出,合并2次药液,使用旋蒸仪浓缩至生药含量3 g·mL-1,密封4 ℃储存备用。

    1.3 试剂与仪器

    卵蛋白(OVA,批号:326A058),美国Sigma公司;兔抗小鼠桥粒芯胶蛋白(Desmocollin)抗体(批号:MAB7367-SP)、兔抗小鼠闭锁小带蛋白-1(ZO-1)抗体(批号:bs-1329R)、兔抗小鼠闭合蛋白(Occludin)抗体(批号:ARG40500)、山羊抗兔多克隆二抗(批号:ab6721),美国Abcam公司;鼠抗β-actin抗体(批号:YM1206),美国ImmunoWay公司;小鼠CCSP ELISA试剂盒(批号:F9206-A);BCA蛋白定量试剂盒(批号:23227),美国Thermo Scientific公司;DEPC水(批号:R0021)、苏木精-伊红(HE)染色液(批号:C0105)、RIPA裂解液(批号:P0013B),南京碧云天生物技术有限公司;总RNA提取试剂盒(批号:9109)、逆转录试剂盒(批号:RR306A)、Real-time PCR定量试剂盒(批号:RR820A),加拿大ABM公司 ......