苏雪蓉,谢颖,娄悦,苏联麟,毛春芹,赵晓莉,陆兔林

    (南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

    鳖血系鳖科动物中华鳖TrionyxsinensisWiegmann的新鲜血液,其药用历史可追溯至唐代。《中华本草》记载,鳖血味甘、咸,性平,归肝经,具有滋阴清热、活血通络的功效,主治虚劳潮热、阴虚低热、胁痛、口眼斜、脱肛等[1]。鳖血还是一种传统的中药炮制辅料,用来炮制柴胡、青蒿、牡丹皮、丹参等[2-6],其中鳖血柴胡作为江西樟帮特色炮制饮片沿用至今。但鳖血作为辅料缺乏全面、系统的质量控制方法,尤其是专属性的鉴别方法。因鳖血量少价高,在市场上可能存在以价廉易得的其他常见动物血液掺伪的现象,影响其药用的安全性和有效性，因此,亟待建立一种特异性的鉴别方法以控制鳖血的质量,进而保障以其炮制的饮片质量。

    随着生物技术的发展,PCR技术已经成为中药鉴定的常用辅助手段之一,在2020年版《中国药典》[6]中,该技术用于乌梢蛇、蕲蛇、金钱白花蛇等动物药材的鉴定。等位基因特异性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)鉴别技术基于物种DNA序列,通过引物3'端碱基与模板的严格配对来实现对SNP位点的检测[7]。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多样性。通过SNP位点设计具有物种特异性的引物,进行PCR反应扩增出目标条带从而进行物种鉴别,具有特异性高、分析速度快、结果准确的优点。

    本研究通过对鳖血以及驴血、牛血、猪血、鸡血、羊血、兔血等常见动物血液的CO Ⅰ序列进行比对分析,根据SNP位点设计鳖血的特异性鉴别引物,使鳖血出现特异性条带,而可能作为伪品掺入的其他动物血液无特异性条带,从而建立鳖血的AS-PCR鉴别方法。研究结果可作为鳖血炮制辅料质量控制的重要指标之一,亦可为血液类药材的现代鉴别提供参考。

    1 材料

    1.1 实验仪器

    VeritiPro PCR仪(Thermo Fisher Scientific);东胜龙ETC811 PCR仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司);Bio-Gener GE9612-T-S PCR仪(杭州柏恒科技有限公司);T100 Thermal Cycler PCR仪(BIO-RAD);SYSTEM GelDoc XR+全自动凝胶成像系统(BIO-RAD);Tanon EPS 300电泳仪(上海天能科技有限公司);Nano-300微量分光光度计(杭州奥盛科技有限公司);Micro CL21R微量台式离心机(Thermo Fisher Scientific) ......