张天驰,李沐哲,牛园园,郭杨,3,王礼宁,3,田霖坤,王遇珩,王泉荃,马勇,3

    (1.南京中医药大学第一临床医学院,骨伤修复与重建新技术实验室,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学附属医院,江苏 南京 210029;3.南京中医药大学无锡附属医院,江苏省中医退行性骨关节病临床医学创新中心,江苏 无锡 214071)

    老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis,SOP)是一种与年龄相关的代谢性骨疾病,以进行性骨量丢失、骨微结构恶化和骨脆性增加为特征,通常发生在65岁以上的人群中[1]。巨噬细胞是骨组织中最丰富、最活跃的免疫细胞之一。在骨髓微环境中,它们与骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC)、成骨细胞和破骨细胞相互作用,在维持骨稳态中起着至关重要的作用。而在衰老的骨髓微环境中,衰老细胞产生衰老相关分泌表型(Senescence associated secretory phenotypes,SASPs),诱导巨噬细胞衰老并向M1型极化[2]。同时,衰老的巨噬细胞会分泌肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等细胞因子,造成成骨细胞和破骨细胞之间的失衡,加剧了年龄相关的骨质流失[2-3]。因此,在治疗SOP方面,调控衰老巨噬细胞、改善骨髓微环境以促进BMSC成骨分化可能是一种新方法。

    马勇教授认为SOP主要病机为肾精亏虚,脾虚肝郁,骨髓失养,故治疗SOP当以补益脾肾、调和脏腑、强筋健骨之法。以此构建的经验方温肾通络止痛方疗效确切(处方已申请国家发明专利,公布号:CN107823493A),能有效提高SOP患者骨密度,改善疼痛、腰膝酸软、步履艰难等症状[3-4],并且可在炎症微环境下通过核因子κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路,调控巨噬细胞极化,抑制破骨细胞活性[5]。而在衰老微环境下,温肾通络止痛方能否通过延缓巨噬细胞衰老,对成骨分化产生影响仍然有待进一步的探索。因此,本研究拟利用过氧化氢(H2O2)建立巨噬细胞衰老模型,并通过D-半乳糖构建SOP小鼠模型,探讨温肾通络止痛方能否通过抑制巨噬细胞衰老促进BMSC成骨分化从而发挥抗骨质疏松效应。

    1 方法

    1.1 试剂

    H-DMEM培养基(Cytiva,批号:SH30022.FS);DMEM/F12培养基(Cytiva,批号:SH30023.01);L-DMEM培养基(Cytiva,批号:SH30021.01);青霉素-链霉素(100×)(新赛美,批号:C100C5);胰蛋白酶消化液(新赛美,批号:C100C1);p21抗体(武汉三鹰,批号:28248-1-AP);p53抗体(武汉三鹰,批号:60283-2-Ig);Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)抗体(武汉三鹰,批号:82636-2-RR);骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)抗体(Santa Cruz,批号:sc-390877);GAPDH抗体(Affinity,批号:AF7021);HRP偶联羊抗兔二抗抗体(武汉三鹰,批号:SA00001-2);HRP偶联羊抗小鼠二抗抗体(武汉三鹰,批号:SA00001-1);iNOS抗体(武汉三鹰,批号:80517-1-RR);ARG1抗体(武汉三鹰,批号:16001-1-AP);CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(武汉三鹰,批号:SA00013-2);CoraLite594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(武汉三鹰,批号:SA00013-4);苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染液(南京建成生物工程研究所,批号:D006-1-1);切片石蜡、脱钙液、4%多聚甲醛(索莱宝,批号:8002-74-2、E1171、P1112);活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、成骨细胞矿化结节染色试剂盒、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、CCK-8试剂盒、免疫荧光染色试剂盒、免疫染色通透液、免疫染色封闭液(碧云天,批号:S0033S、C0602、C0148S、C3206、C2006、C0037、P0186、P0096、P260);地塞米松、β-磷酸甘油磷酸钠、维生素C(Sigma,批号:265005、G9422、BP461);总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司,批号:RC101-01、R223-01、Q711-02) ......