赖梦亭,麦麦提敏·麦提萨伍尔,李彤,肖平,宿树兰,段金廒

    (南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/国家中医药管理局中药资源循环利用重点研究室,江苏 南京 210023)

    中药多糖因其资源丰富、来源天然、生物活性好、毒副作用小等优势成为近年来天然药物的研究热点[1]。研究发现中药多糖具有免疫调节作用,临床常用作免疫调节剂[2-3],如香菇多糖具有显著的抗肿瘤活性,在临床上被用作抗肿瘤的佐剂,配合放化疗药物使用可以起到增强机体免疫力、减轻不良反应的作用[4]。多糖类成分是板蓝根的主要活性成分之一,具有显著的免疫调节作用[5-7],但未经脱蛋白的板蓝根多糖中含有大量的蛋白质杂质,难以实现质量控制,与多糖结合的蛋白会干扰多糖结构分析和生物活性研究,甚至影响多糖生物活性的发挥,因此对多糖进行脱蛋白处理是探究多糖结构及生物活性的重要内容。常用的脱蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸法和大孔树脂分离法等,但上述方法存在操作过程繁琐、脱蛋白效率低、有机溶剂用量大且不易去除等缺点,而酶法具有不破坏多糖原有结构、脱蛋白效率高、经济环保等优点[8]。

    斑马鱼的基因序列与人类基因有87%相似度,免疫系统、心血管系统、代谢系统的生理结构与哺乳动物高度类似[9]。斑马鱼幼鱼主要依赖固有免疫,免疫细胞类型包括巨噬细胞和中性粒细胞,斑马鱼体型小、胚胎及幼鱼透明、繁殖能力强、发育迅速,借助化学染色手段以及免疫细胞荧光标记转基因品系斑马鱼,在高分辨显微镜下可以实现斑马鱼活体成像、细胞追踪和器官观察[10]。

    本研究以多糖保留率和蛋白脱除率的综合评分为指标,通过单因素实验和Box-Behnken响应面法筛选酶种类和酶解条件,确定最佳酶法除蛋白工艺。并对脱蛋白前后的板蓝根多糖进行了紫外扫描、红外光谱、分子量测定,测定了脱蛋白板蓝根多糖的单糖组成。进一步评价脱蛋白后的板蓝根多糖对免疫低下斑马鱼免疫细胞、免疫因子的影响,以期为板蓝根多糖的开发利用与质量控制提供科学依据。

    1 材料

    1.1 仪器

    ENSPIRE多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司);Z323K低温高速离心机(德国Beckman公司);G-9双光路紫外扫描仪(南京菲勒仪器有限公司);FT-IR傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司);Waters2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司);ESEN-AW-RC2-SS小型水体循环单元(北京爱生科技发展有限公司);BSG-300光照培养箱(博迅生物仪器);DFC17000T体式荧光显微镜(Leica Microsystems公司) ......