加味丹参饮预处理对乳鼠缺氧/复氧心肌细胞的延迟保护作用及对蛋白激酶C的影响(1)
摘要：目的 观察加味丹参饮预处理对乳鼠缺氧復氧心肌细胞的延迟保护作用及对蛋白激酶C(PKC)的影响。方法 将培养72 h的乳鼠心肌细胞随机分为6组，空白组正常培养；血清对照组加50%大鼠血清培养；含药血清組加50%含加味丹参饮的药物血清培养；缺氧/复氧组予缺氧再给氧。缺氧预处理组、加味丹参饮预处理组先给予缺氧预处理和加味丹参饮预处理，24 h后再予缺氧再给氧。结果 加味丹参饮预处理24 h后可防止缺氧/复氧心肌细胞存活率的降低，防止乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的升高(P<0.01)，提高蛋白激酶C活性(P<0.01)。结论 加味丹参饮预处理具有延迟保护作用，其机制与激发细胞内PKC信号转导通路有关。
关键词：加味丹参饮；预处理；延迟保护；心肌细胞；蛋白激酶C
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)10-0953-03
反复短暂缺血一再灌注以激发自身的适应性反应，使心肌对随后发生的持续性缺血的耐受力提高称为缺血预处理(IPC)。缺血预处理可防止心肌缺血再灌注损伤，具有良好的临床应用前景。IPC对心肌的保护作用分为早期保护作用(EPC)与延迟保护作用(DPC)。目前关于中药复方延迟保护作用的研究较少。本研究观察加味丹参饮预处理的延迟保护作用，并观察其对蛋白激酶C(PKC)的影响，以期为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 出生72 h的Wistar大鼠30只，成年大鼠10只，体重(200±20)g，雌雄各半，均由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2003～0003。
1.1.2 药物 加味丹参饮由丹参20g、檀香6g、赤芍10g、川芎6g、当归6g、红花6 g、生地12g等组成。由湖南中医药大学第一附属医院药房提供，经干燥、称重、浸泡、煎煮3次，浓缩至含生药2g/mL。
1.1.3 仪器及试剂 凝胶成像分析系统(BIORAD公司)、U-2001紫外分光光度计(日立公司)、低温高速离心机(Sigma公司)、PepTag非放射性蛋白激酶试剂盒(Promega公司)、WIP组织细胞裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)、乳酸脱氢酶(LDH，南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶(CK，南京建成生物工程研究所)、DMEM(Gibeo公司)、胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)。
1.2 方 法
1.2.1 体外大鼠心肌细胞的培养 参照《药理实验方法学》中新生大鼠心脏细胞的培养方法，将出生72 h的30只Wistar大鼠，无菌条件下剪取心室。剪下的心脏用PBS(磷酸缓冲液)洗涤后，剪去心房，将心室剪成1 mm3碎块，用0.125%胰蛋白酶37℃水浴中消化10 min，弃上清，再加入胰蛋白酶液消化10min，将上清液及沉淀物分别处理。上清液移至另一无菌离心管中，加入PBS离心，弃上清液。重复(1～3)次，充分洗去胰蛋白酶。消化处理之后，将心肌细胞加入含20%胎牛血清的DMEM培养液中制成细胞悬液。将沉淀组织块再加胰蛋白酶消化，沉淀，其上清液重复前述步骤，反复消化(3～8)次，制成心肌细胞悬液。将所有细胞悬液移到细胞培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中放置1.5 h，除去已贴壁的成纤维细胞。收集未贴壁的细胞悬于含20%胎牛血清的DMEM培养液中，调细胞浓度为3×106/mL，接种于25 cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。每2d更换培养液，取培养3d的细胞单层进行实验。
1.2.2 心肌细胞缺氧復氧(H/R)损伤实验法 参照《药理实验方法学》进行。DMEM培养液用高纯氮气饱和30 min，使培养液氧分压低于4.00 kPa(30 mmHg)。心肌细胞单层换用缺氧培养液后。培养液内立即冲入氮气(1L/min流量)30 s以驱除瓶内氧气，然后塞紧瓶塞密闭培养。缺氧不同的时间后可造成心肌细胞不同程度的损害。按此方法造成心肌细胞缺氧，缺氧3h后换用正常DMEM培养液培养1h，造成再给氧损伤。
1.2.3 药物血清制备 参照《药理实验方法学新技术与新方法》中方法。取10只Wistar大鼠按区组随机法分为血清对照组和药物血清组，分别制备对照血清和药物血清。药物血清组灌胃加味丹参饮药液，剂量是根据成人每日临床用量按人与动物之间药物剂量换算而成(利用mg/kg折算mg/m2转换因子”进行计算)，大鼠每日药量为6.42 g/kg，每日2次，连续3d。血清对照组灌以等量生理盐水。于最后1次给药后1 h，无菌条件下，颈总动脉取血，分离血清；56℃、30min灭活补体ψ0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
1.2.4 分组及给药 将培养3d的乳鼠心室肌细胞随机分为6组，每组6个样本。空白组：继续培养24h，更换培养液再培养24 h。空白血清对照组：培养液中加入50%大鼠血清培养24 h，然后更换培养液继续培养24 h。含药血清对照组：培养液中加入50%含加味丹参饮的药物血清培养24 h，然后更换培养液继续培养24 h。缺氧/复氧(H/R)组：继续培养24 h，更换培养液再继续培养24 h，然后缺氧3 h，再给氧1 h。缺氧预处理(HPC)组：继续培养24 h，然后缺氧30 min，复氧30 min，更换培养液再继续培养24 h，然后缺氧3 h，再给氧1 h。加味丹参饮预处理组：给50%含加味丹参饮的药物血清培养24 h，然后更换培养液继续培养24 h后予缺氧3 h，再给氧1 h。
1.2.5 PKC的提取与测定 参照WIP组织细胞裂解液说明书操作。每瓶细胞加入含PMSF的WIP裂解液(一般每次裂解5×1061×107细胞，每次用1 mL裂解液)，于冰上裂解30min。裂解完后，将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中(整个操作尽量在冰上进行)。于4 ℃下12 000 r/min离心5min。将离心后的上清分装转移到0.5 mL的离心管中放于一20℃保存。
1.3 观察指标
1.3.1 细胞存活率、LDH及CK活性测定 以台盼蓝染色法测定细胞存活率，取培养细胞上清液以比色法测定LDH，CK活性。
1.3.2 PKC测定 具体操作按PepTag非放射性蛋白激酶试剂盒说明书进行。0.5 mL离心管中依次加入反应缓冲液、PKC激活液、C1短肽，30℃预孵育2 min，加入样品或对照，使反应总体积为25μL。充分混匀，30℃孵育30 min后，离心管置于, http://www.100md.com(王庆高 黄政德 肖 健 刘 靖 祝美珍)
关键词：加味丹参饮；预处理；延迟保护；心肌细胞；蛋白激酶C
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349(2007)10-0953-03
反复短暂缺血一再灌注以激发自身的适应性反应，使心肌对随后发生的持续性缺血的耐受力提高称为缺血预处理(IPC)。缺血预处理可防止心肌缺血再灌注损伤，具有良好的临床应用前景。IPC对心肌的保护作用分为早期保护作用(EPC)与延迟保护作用(DPC)。目前关于中药复方延迟保护作用的研究较少。本研究观察加味丹参饮预处理的延迟保护作用，并观察其对蛋白激酶C(PKC)的影响，以期为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 出生72 h的Wistar大鼠30只，成年大鼠10只，体重(200±20)g，雌雄各半，均由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2003～0003。
1.1.2 药物 加味丹参饮由丹参20g、檀香6g、赤芍10g、川芎6g、当归6g、红花6 g、生地12g等组成。由湖南中医药大学第一附属医院药房提供，经干燥、称重、浸泡、煎煮3次，浓缩至含生药2g/mL。
1.1.3 仪器及试剂 凝胶成像分析系统(BIORAD公司)、U-2001紫外分光光度计(日立公司)、低温高速离心机(Sigma公司)、PepTag非放射性蛋白激酶试剂盒(Promega公司)、WIP组织细胞裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)、乳酸脱氢酶(LDH，南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶(CK，南京建成生物工程研究所)、DMEM(Gibeo公司)、胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)。
1.2 方 法
1.2.1 体外大鼠心肌细胞的培养 参照《药理实验方法学》中新生大鼠心脏细胞的培养方法，将出生72 h的30只Wistar大鼠，无菌条件下剪取心室。剪下的心脏用PBS(磷酸缓冲液)洗涤后，剪去心房，将心室剪成1 mm3碎块，用0.125%胰蛋白酶37℃水浴中消化10 min，弃上清，再加入胰蛋白酶液消化10min，将上清液及沉淀物分别处理。上清液移至另一无菌离心管中，加入PBS离心，弃上清液。重复(1～3)次，充分洗去胰蛋白酶。消化处理之后，将心肌细胞加入含20%胎牛血清的DMEM培养液中制成细胞悬液。将沉淀组织块再加胰蛋白酶消化，沉淀，其上清液重复前述步骤，反复消化(3～8)次，制成心肌细胞悬液。将所有细胞悬液移到细胞培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中放置1.5 h，除去已贴壁的成纤维细胞。收集未贴壁的细胞悬于含20%胎牛血清的DMEM培养液中，调细胞浓度为3×106/mL，接种于25 cm2的培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。每2d更换培养液，取培养3d的细胞单层进行实验。
1.2.2 心肌细胞缺氧復氧(H/R)损伤实验法 参照《药理实验方法学》进行。DMEM培养液用高纯氮气饱和30 min，使培养液氧分压低于4.00 kPa(30 mmHg)。心肌细胞单层换用缺氧培养液后。培养液内立即冲入氮气(1L/min流量)30 s以驱除瓶内氧气，然后塞紧瓶塞密闭培养。缺氧不同的时间后可造成心肌细胞不同程度的损害。按此方法造成心肌细胞缺氧，缺氧3h后换用正常DMEM培养液培养1h，造成再给氧损伤。
1.2.3 药物血清制备 参照《药理实验方法学新技术与新方法》中方法。取10只Wistar大鼠按区组随机法分为血清对照组和药物血清组，分别制备对照血清和药物血清。药物血清组灌胃加味丹参饮药液，剂量是根据成人每日临床用量按人与动物之间药物剂量换算而成(利用mg/kg折算mg/m2转换因子”进行计算)，大鼠每日药量为6.42 g/kg，每日2次，连续3d。血清对照组灌以等量生理盐水。于最后1次给药后1 h，无菌条件下，颈总动脉取血，分离血清；56℃、30min灭活补体ψ0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存备用。
1.2.4 分组及给药 将培养3d的乳鼠心室肌细胞随机分为6组，每组6个样本。空白组：继续培养24h，更换培养液再培养24 h。空白血清对照组：培养液中加入50%大鼠血清培养24 h，然后更换培养液继续培养24 h。含药血清对照组：培养液中加入50%含加味丹参饮的药物血清培养24 h，然后更换培养液继续培养24 h。缺氧/复氧(H/R)组：继续培养24 h，更换培养液再继续培养24 h，然后缺氧3 h，再给氧1 h。缺氧预处理(HPC)组：继续培养24 h，然后缺氧30 min，复氧30 min，更换培养液再继续培养24 h，然后缺氧3 h，再给氧1 h。加味丹参饮预处理组：给50%含加味丹参饮的药物血清培养24 h，然后更换培养液继续培养24 h后予缺氧3 h，再给氧1 h。
1.2.5 PKC的提取与测定 参照WIP组织细胞裂解液说明书操作。每瓶细胞加入含PMSF的WIP裂解液(一般每次裂解5×1061×107细胞，每次用1 mL裂解液)，于冰上裂解30min。裂解完后，将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL离心管中(整个操作尽量在冰上进行)。于4 ℃下12 000 r/min离心5min。将离心后的上清分装转移到0.5 mL的离心管中放于一20℃保存。
1.3 观察指标
1.3.1 细胞存活率、LDH及CK活性测定 以台盼蓝染色法测定细胞存活率，取培养细胞上清液以比色法测定LDH，CK活性。
1.3.2 PKC测定 具体操作按PepTag非放射性蛋白激酶试剂盒说明书进行。0.5 mL离心管中依次加入反应缓冲液、PKC激活液、C1短肽，30℃预孵育2 min，加入样品或对照，使反应总体积为25μL。充分混匀，30℃孵育30 min后，离心管置于, http://www.100md.com(王庆高 黄政德 肖 健 刘 靖 祝美珍)