王 宁,李新华,邢万红,陈 平

    间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞[1],它广泛存在于成体器官和结缔组织中[2],最早发现于骨髓[3]。骨髓来源的间充质干细胞是一种比较原始的骨髓基质细胞,被称为骨髓间充质干细胞/祖细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs),也被称为骨髓来源的多潜能基质细胞[4]。自从Wakitani等报道MSCs可以分化为心肌细胞,M angi等[5]报道MSCs可以修复损伤的心脏以来,MSCs成为心脏修复和心肌组织工程种子细胞最热门的候选来源。但其骨髓中的含量很低,仅占骨髓中单个核细胞的1/106～1/105。细胞在扩增过程中保持多潜能性,但该能力会随着过度扩增和不恰当操作而减弱[4],因此本实验探讨大鼠MSCs细胞代数对增值与诱导分化能力的影响,及在能获得充足细胞数量的同时,又不减弱细胞多潜能性的最佳时期。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物及材料 清洁级雄性SD大鼠,4周龄,体重100 g～120 g,由山西医科大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。胎牛血清(美国HyClone公司);5-氮胞苷(5-Azα,美国 Sigma公司);噻唑兰(M TT,美国Sigma公司);一抗:兔抗鼠cT nT抗体(上海蓝基生物科技有限公司),兔抗鼠α-action抗体(上海蓝基生物科技有限公司);过氧化物酶标记的链霉素卵白素染色试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司)。

    1.2 大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养 CO2窒息处死动物,无菌条件下取大鼠股骨和胫骨,以完全培养液冲洗骨髓腔。按照1:1的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为1.077 g/mL的Percoll分离液上层,1 500 r/min离心30 min。吸取上、中层液面间的乳白色云雾状的单个核细胞层,加入完全培养液重悬,离心洗涤2次。加入培养液以2×105/cm2～3×105/cm2

    细胞密度接种于细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2,饱和湿度的孵箱内培养 72 h换液,达60%～70%融合状态,传代培养。

    1.3 各代大鼠骨髓间充质干细胞增殖率测定及体外诱导 取第2代MSCs,消化后调整细胞悬液浓度至3×104/mL,接种于7个96孔板,每孔加入200 L,设调零孔5个 ......