从钙超载角度探讨通脉养心丸心肌保护作用的机制(2)
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1.6检测指标 MTT比色法测定心肌细胞活力，并应用分析软件对心肌细胞浆钙离子浓度百分率与心肌细胞凋亡率进行相关性考察与回归分析，论证二者是否具有某种相关性。心肌细胞胞浆内钙离子浓度，数据用每孔细胞再次加药后荧光值占空白组荧光值的百分率表示。计算凋亡细胞百分率。
1.7统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS 11.0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析。
2结果
2.1通脉养心丸对心肌细胞活力的影响心肌细胞在缺氧条件下孵育后，其活力下降，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01)。证明缺氧损伤模型建立成功。通脉养心丸各个剂量组均能不同程度提高缺氧损伤心肌细胞活力，其中1 g/kg剂量组与缺氧损伤组比较有统计学意义(P<0.05)；通脉养心丸2 g/kg、4 g/kg、8 g/kg剂量组与缺氧损伤组比较有统计学意义(P<0.01)。详见表1。
2.2对缺氧损伤心肌细胞胞浆中钙离子浓度变化的影响缺氧孵育24 h后缺氧损伤组胞浆中钙离子浓度与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01)。再次加药后，约在40 s后各组细胞胞浆内钙离子浓度达到峰值，各给药组峰值与缺氧损伤组比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中8 g/kg组效果最为明显。再次加药80 s~300 s各组钙离子浓度逐渐趋于稳定，此时各给药组钙离子浓度仍显著低于缺氧损伤组(P<0.01)。详见图1。
与空白对照组比较，1) P<0.01；与缺氧损伤组比较，2) P<0.01
图1通脉养心丸对缺氧心肌细胞钙离子荧光强度的影响
2.3对缺氧损伤心肌细胞凋亡率的影响心肌细胞经缺氧损伤后，与空白对照组相比细胞凋亡率明显升高(P<0.01)；通脉养心丸4 g/kg、8 g/kg剂量组与缺氧损伤组比较能明显降低缺氧心肌细胞凋亡率(P<0.01)。详见表2。
2.4胞浆钙离子浓度与凋亡率的相关性各剂量组钙离子浓度荧光百分率与细胞凋亡率相关系数为0.945，成明显正相关。经回归分析95%可信区间(P<0.05)，二者存在线性回归关系。
3讨论
通脉养心丸全方由生脉散与炙甘草汤加减而成，具有养心补血，通脉止痛的功效。方中地黄、鸡血藤、何首乌以及麦冬均具有钙离子拮抗作用，可不同程度抑制钙超载[2,3] 。
细胞凋亡信号的异常表达使心肌细胞数量不可逆地减少，加重了心肌缺血损伤[4]。其发生凋亡的机制可能与长时间缺氧产生细胞内钙超载有关[5]。钙离子作为多种死亡信号转导的第二信使与细胞线粒体凋亡有着错综复杂的关系[6]，心肌缺血发生时，大量钙离子内流，同时钙离子的排出受到抑制，导致心肌细胞钙超载。此时，线粒体可释放CytC，CytC与脱氧腺苷三磷酸相互作用，并与Apaf-1结合，激活白细胞介素-1,3转化酶-9(Caspase-9)，被激活的Caspase-9又激活Caspase-3，促使细胞发生凋亡 [7]。
本实验结果显示，缺氧条件可使心肌细胞胞浆内钙离子浓度显著升高，通脉养心丸4 g/kg、8 g/kg剂量组可以明显抑制心肌细胞内钙离子浓度升高，一定程度上减轻了心肌细胞钙超载。此外，通脉养心丸4 g/kg、8 g/kg剂量组可明显降低缺氧损伤引起的大鼠心肌细胞凋亡的发生率，对缺氧损伤的心肌细胞具有明显的保护作用。
本研究从心肌细胞胞浆内钙离子浓度变化为切入点，结合心肌细胞凋亡率对通脉养心丸心肌保护机制进行了初步探讨，二者的相关性说明该药能够通过抑制心肌细胞钙超载而降低心肌细胞凋亡的发生，进而发挥心肌保护作用。同时提示了该药剂量与疗效间也具有一定的依赖关系。通脉养心丸能否通过其他途径发挥心肌保护作用仍有待于进一步的研究。
参考文献：
[1]Michaela A，Tomas S，Helena K，et al.In vitro and in vivo examination of cardiac troponins as biochemical markers of drug-induced cardiotoxicity[J].Toxicology,2007,237(2):218-228.
[2]陈丁丁，戴德哉，章涛，等.地黄煎剂抑制异丙肾上腺素诱发的缺血大鼠脑Ca2+ -Mg2+ -ATP酶活力升高[J].中药药理与临床，1997，13(4):27-28.
[3]江涛，唐春萍，李娟妤，等.鸡血藤对大鼠主动脉收缩反应的影响[J].广东药学院学报，1996，12(1)：33-35.
[4]陈万生，刘文庸，杨根金，等.首乌中1个新的四羟基二苯乙烯苷的结构鉴定及其心血管活性研究[J] ......
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