依达拉奉对大鼠癫痫持续状态神经元细胞凋亡的影响(1)
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摘要：目的研究自由基清除剂依达拉奉对大鼠癫痫持续状态(SE)后神经元细胞凋亡的影响。方法采用氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态模型，实验Wistar大鼠随机分为实验组(72只)和对照组(C组，6只)，实验组分为模型组(M组)、依达拉奉单药治疗组(ED组)、联合地西泮治疗组(ED+DI)，每组按照时间点分为4个亚组(12 h、24 h、72 h、7 d)。免疫组化法检测大鼠脑组织的Bcl-2蛋白表达,及TUNEL法检测细胞凋亡的情况。结果Bcl-2蛋白表达与对照组相比，M组12 h达高峰，24 h开始减少， 7 d减至基础水平(P<0.05)。而依达拉奉单药和联合地西泮治疗组与之比较，变化趋势相同但Bcl-2表达增多(P<0.05)；M组TUNEL染色阳性细胞极多，12 h开始上升，48 h达高峰，之后有下降趋势(P<0.01)。ED组TUNEL染色阳性细胞数值变化趋势相同但低于M组(P<0.01)，高于ED+DI组；ED+DI组与C相比仍有统计学意义(P<0.05)。结论依达拉奉对氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫持续状态所致脑损伤具有保护作用，其机制可能通过清除自由基上调Bcl-2蛋白表达及减少神经元细胞凋亡，联合地西泮治疗效果更显著。
关键词：依达拉奉 癫痫持续状态 Bcl-2 神经元凋亡
中图分类号：R742.1R255文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0585-02
本实验拟采用依达拉奉及与地西泮联合治疗观察其对癫痫持续状态神经元细胞凋亡的影响。
1材料与方法
1.1材料清洁级健康成年雄性Wistar大鼠，体重200 g～250 g，由山西医科大学生理教研室动物中心提供；氯化锂购自中国医药集团上海试剂公司;匹罗卡品购自美国Sigma公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体、TUNEL试剂盒、即用型SABC试剂盒均系武汉博士德公司产品;DAB试剂由北京中杉金桥生物技术有限公司出品;依达拉奉系江苏南京先声药业有限公司生产。
1.2方法
1.2.1动物分组78只Wistar大鼠随机分为实验组(72只)和对照组(C组，6只)，实验组分为模型组(M组)、依达拉奉单药治疗组(ED组)、联合地西泮治疗组(ED+DI)，每组按照时间点分为4个亚组(12 h、24 h、72 h、7 d)。实验动物饲养于正常昼夜环境中，给予标准饲料及饮水。
1.2.2动物模型制备氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态模型制作,腹腔注射氯化锂3 mEq/kg，20 h后再腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30 mg/kg。对照组大鼠给予生理盐水腹腔注射。大鼠在15 min~45 min出现反复强直-阵挛发作，形成癫痫持续状态。按照经典的Racine癫痫发作行为标准进行癫痫行为观察记录。实验组动物发作级别均达到Ⅳ级～Ⅴ级以上提示造模成功。干预组大鼠在癫痫发作后1 h腹腔注射依达拉奉20 mg/kg，联合治疗组同时腹腔注射地西泮10 mg/kg，随机分为按照发作后12 h、24 h、72 h、7 d再分为实验组4个亚组。
1.3标本采集与处理实验组大鼠分别在癫痫持续状态发作后12 h、24 h、72 h、7 d与对照组大鼠，用5%水合氯醛按5 ml/kg腹腔注射麻醉,断头取脑。大鼠脑组织在4%的多聚甲醛中固定24 h，经石蜡包埋后，在海马部位作矢状位切片，片厚约5μm。HE染色,光镜下观察形态学变化。
1.3.1Bcl-2蛋白免疫组化染色按照常规SABC法进行免疫组化检测，DAB显色，苏木精轻度复染。每张切片取5个视野(×400倍)，测定每个视野的阳性细胞数，取其平均值。
1.3.2TUNEL染色以不加TdT酶作为阴性对照，细胞核染成棕褐色的为凋亡阳性细胞。每张切片取5个视野(×400倍)，计数每个视野的阳性细胞数，取其平均值。
1.3.3图像分析采用Mias(2000型)图像分析系统对海马及海马皮层Bcl-2蛋白、TUNEL阳性细胞进行定量计数。
1.4统计学处理采用SPSS 13.0软件进行处理。检测结果以均数±标准差(x±s)表示。多样本均数比较采用方差分析，两两比较采用t检验。
2结果
2.1行为学观察正常对照组未出现癫痫发作。实验组大鼠在给予匹罗卡品后15min～30 min均出现洗脸样动作、节律性咀嚼、点头等面部痉挛样动作；随后出现前肢阵挛，之后很快表现为前肢阵挛伴站立，进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒，反复发作，达到癫痫持续状态。实验组大鼠成功72只，成功率 92.3%，死亡2只，并随机补充。
2.2HE 染色结果正常对照组神经元排列整齐紧密，细胞呈圆形或椭圆形，胞浆透明且染色质分布均，核仁清晰；模型组出现了嗜酸性神经元，表现为细胞排列紊乱，胞体收缩明显，胞浆红染，胞核固缩；依达拉奉组也出现嗜酸性神经元，但数量较少，细胞排列松散；联合治疗组嗜酸性神经元极少，但细胞排列尚整齐，形态接近于正常。
2.3Bcl-2蛋白的表达情况细胞浆及核膜内出现黄色或棕黄色样物质为Bcl-2阳性细胞。每张切片取5×400倍视野，计数每个视野的阳性细胞数，取其平均值。C组有基础量的Bcl-2蛋白表达。与对照组相比，M组Bcl-2蛋白表达12 h达高峰，24 h开始减少，48 h继续减低，72 h到7 d减至基础水平(P<0.05)。ED组大鼠Bcl-2蛋白表达在12 h最高，24 h、48 h逐渐减少，7 d时仍高于M组(P<0.05)。ED+DI的Bcl-2蛋白表达与ED组趋势相同，但均高于ED组(P<0.05)。详见表1。
2.4TUNEL染色结果TUNEL染色阳性细胞即凋亡细胞，主要表达在神经元及神经胶质细胞，表现为胞核中出现棕色颗粒，固缩聚集在核膜周边，呈典型的指环状或新月状的凋亡特征。M组TUNEL染色阳性细胞表达水平在12 h开始上升，48 h达高峰，之后有下降趋势(P<0.01)。ED组TUNEL染色阳性细胞数值变化趋势相同但低于M组(P<0.01)，高于ED+DI组；ED+DI组与C相比仍有差别(P<0.05)。详见表2。
1)为山西医科大学第二医院院青年基金资助(No.20090202)
3讨论
癫痫对神经系统的损害并非随放电的终止而停止,一次癫痫急性发作就足以引起脑部特定区域神经元的脱失[1,2]，且损伤程度与发作别相关[3]。癫痫时伴有非常活跃的自由基活动[4,5]。自由基在癫痫损伤机制可能通过以下几点： 自由基的神经毒性作用,在癫痫急性发作病理过程中，大脑内过量产生的自由基通过灭活谷氨酰胺合成酶来促进兴奋性神经递质谷氨酸的异常增加,促进癫痫发生、发展；自由基使细胞膜离子通透性增加,使Ca2+内流增加,导致进行性去极化,引起神经细胞异常放电；自由基参与了癫痫发病病理过程 ......
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