麝香保心丸对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞增殖及氧化应激的影响(2)
参见附件(12kb)。
Key words:Shexiang Baoxin pills；endothelial cells；oxidative stress
血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着重要的作用。氧化应激引起的血管内皮细胞功能异常主要表现在内皮细胞炎症因子表达增加以及内皮细胞内因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH)氧化酶的激活促使活性氧离子(reactive oxygen species,ROS)的生成[1,2]。麝香保心丸作为一种用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病以及冠脉介入(PCI)术后再狭窄的有效药物，具有保护血管内皮、抑制动脉粥样硬化形成的作用，但是其相关作用机制尚未完全清楚。本研究通过观察麝香保心丸制备大鼠血清对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖活性、细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及细胞内NADPH氧化酶亚基gp91、p22 mRNA表达的影响，探讨麝香保心丸抗动脉硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 标本的采集 实验中所用脐带全部来自于福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖宫产后的新鲜胎儿脐带(孕妇自愿提供)，M199培养液中4 ℃保存，2 h内进行分离培养。
1.2 主要材料和试剂 I型胶原酶(GIBCO)，M199培养基(GIBCO),胎牛血清(FBS,GIBCO)，胰蛋白酶(GIBCO)，PBS(北京中杉)，Trizol试剂盒(Invitrogen);RT-PCR试剂盒(Fermentas)，M-MLV反转录酶、oligo(dT)15 (Promega)；Taq酶(Takara),Marker(Ferments)，引物设计、合成由上海Invitrogen公司完成；SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其他常用试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 麝香保心丸动物血清制备 称取麝香保心丸原粉0.5 g、1 g、2 g充分溶解于5 mL水中,采用灌胃法连续给药3 d，1 mL/100 g大鼠,第4天灌胃给药后4 h断头取血，3 500 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm过滤器过滤，-70 ℃保存备用,以对照组(未给药大鼠)血清为对照血清组，上述制备血药浓度为体外细胞干预10×血清，血药浓度分别为0.5 g/L、1 g/L、2 g/L，分别定为0.5 g药物血清组、1 g药物血清组、2 g药物血清组。
1.3.2 HUVEC细胞培养 无菌条件下取本院产科剖宫产分娩的新生儿脐带约15 cm，置于预先准备的装有M199培养液的无菌瓶中,按Jaffe等[3]的方法加以改进，使用0.1%I型胶原酶消化，用含20%FBS的M199培养基在37 ℃ CO2培养箱中培养。待细胞长至80%～90%汇合时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取3代～5代细胞进行实验。
1.3.3 溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)插入法检测人脐静脉内皮细胞活性 取3代～5代内皮细胞消化接种于96孔培养板中，104个细胞/孔,待其生长至70%～80%汇合时更换2%FBS培养基90 μL/well 24 h,加入含不同浓度麝香保心丸血清10 μL/well， 30 min～45 min后加入H2O2 10 μL(终浓度50 μg/mL)继续培养24 h， 加入10×BrdU 10 μL/well 37 ℃孵育2 h～3 h ......
Key words:Shexiang Baoxin pills；endothelial cells；oxidative stress
血管内皮细胞在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着重要的作用。氧化应激引起的血管内皮细胞功能异常主要表现在内皮细胞炎症因子表达增加以及内皮细胞内因烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH)氧化酶的激活促使活性氧离子(reactive oxygen species,ROS)的生成[1,2]。麝香保心丸作为一种用于治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病以及冠脉介入(PCI)术后再狭窄的有效药物，具有保护血管内皮、抑制动脉粥样硬化形成的作用，但是其相关作用机制尚未完全清楚。本研究通过观察麝香保心丸制备大鼠血清对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖活性、细胞上清液中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及细胞内NADPH氧化酶亚基gp91、p22 mRNA表达的影响，探讨麝香保心丸抗动脉硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 标本的采集 实验中所用脐带全部来自于福建医科大学附属第一医院住院育龄健康产妇剖宫产后的新鲜胎儿脐带(孕妇自愿提供)，M199培养液中4 ℃保存，2 h内进行分离培养。
1.2 主要材料和试剂 I型胶原酶(GIBCO)，M199培养基(GIBCO),胎牛血清(FBS,GIBCO)，胰蛋白酶(GIBCO)，PBS(北京中杉)，Trizol试剂盒(Invitrogen);RT-PCR试剂盒(Fermentas)，M-MLV反转录酶、oligo(dT)15 (Promega)；Taq酶(Takara),Marker(Ferments)，引物设计、合成由上海Invitrogen公司完成；SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；其他常用试剂均为分析纯。
1.3 方法
1.3.1 麝香保心丸动物血清制备 称取麝香保心丸原粉0.5 g、1 g、2 g充分溶解于5 mL水中,采用灌胃法连续给药3 d，1 mL/100 g大鼠,第4天灌胃给药后4 h断头取血，3 500 r/min离心10 min，取上清液，0.22 μm过滤器过滤，-70 ℃保存备用,以对照组(未给药大鼠)血清为对照血清组，上述制备血药浓度为体外细胞干预10×血清，血药浓度分别为0.5 g/L、1 g/L、2 g/L，分别定为0.5 g药物血清组、1 g药物血清组、2 g药物血清组。
1.3.2 HUVEC细胞培养 无菌条件下取本院产科剖宫产分娩的新生儿脐带约15 cm，置于预先准备的装有M199培养液的无菌瓶中,按Jaffe等[3]的方法加以改进，使用0.1%I型胶原酶消化，用含20%FBS的M199培养基在37 ℃ CO2培养箱中培养。待细胞长至80%～90%汇合时用0.25%胰蛋白酶进行消化传代，取3代～5代细胞进行实验。
1.3.3 溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)插入法检测人脐静脉内皮细胞活性 取3代～5代内皮细胞消化接种于96孔培养板中，104个细胞/孔,待其生长至70%～80%汇合时更换2%FBS培养基90 μL/well 24 h,加入含不同浓度麝香保心丸血清10 μL/well， 30 min～45 min后加入H2O2 10 μL(终浓度50 μg/mL)继续培养24 h， 加入10×BrdU 10 μL/well 37 ℃孵育2 h～3 h ......
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