杜 洪，阴怀清，闫焕利，范泽卫，郭晋伟

    缺氧缺血性脑病(HIE)是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因之一[1]。促红细胞生成素(EPO)对缺氧缺血的脑组织有保护作用[2]，但其作用机制尚未完全清楚。本实验通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型，观察EPO对新生大鼠HIBD后脑组织HIF-1α及凋亡相关蛋白存活素(Survivin)表达的影响，探讨其发挥神经保护的可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 试剂与药品 一抗：兔抗鼠HIF-1α和Survivin，二抗：即用型SABC试剂盒，细胞凋亡检测试剂盒(POD)，均购自武汉博士德公司。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。人重组促红细胞生成素(rhEPO)系成都地奥九泓制药厂生产。

    1.2 动物分组及模型制备 清洁级，封闭群，新生7dWistar大鼠120只，体重12g～16g，雌雄不限，购自山西医科大学实验动物中心。随机分为假手术组、HIBD组、rhEPO治疗组，后两者根据处死时间亚组：3h组、6h组、12h组、24h组、48h组、3d组、7d组，每组8只。假手术组给予麻醉后切开颈部皮肤，不结扎颈总动脉，不进行缺氧处理。采用经典Rice法[3]制成HIBD动物模型。rhEPO治疗组给予麻醉后切开颈部皮肤，结扎左侧颈总动脉并置于缺氧仓中(含8%氧气)2h，模型建立后，分别于缺氧缺血后即刻、24h、48h各时间点连续腹腔注射rhEPO(5 000IU/kg)。

    1.3 标本制备 分别在3h、6h、12h、24h、48h、3d、7d处死各组动物，断头取左侧脑组织，10%多聚甲醛室温固定24h，切块，石蜡包埋后，连续做冠状切片。

    1.4 免疫组化

    1.4.1 HIF-1α的检测 切片经常规脱蜡后放置至蒸馏水中，3%H2O2室温孵育15min，枸橼酸缓冲液高压热修复2.5min，降 温至室温，PBS液洗2min×3次，滴加HIF-1α的一抗(1∶200)，湿盒置于4℃冰箱中过夜，复温至室温，PBS液洗2 min×3次，滴加二抗：抗兔IgG抗体。用DAB显色剂显色，苏木素复染。脱水，透明，中性树胶封片。阴性对照切片用PBS液代替一抗，余步骤相同 ......