急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞miR-146a表达及其与炎症因子的相关性研究(1)
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摘要：目的 研究急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单个核细胞内MicroRNA146a (miR146a)基因的表达，并探讨炎症因子及其表达水平的相关性。方法 分离26例急性心肌梗死(AMI)、25例不稳定型心绞痛(UA)、22例稳定型心绞痛(SA)、18例胸痛综合征(CPS)患者外周血单个核细胞(PBMC)，采用Realtime PCR法及Northern blot法检测各组患者PBMC中miR146a的表达水平，同时，将分离的PBMC在体外经植物血凝素(PHA)刺激培养后，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养基上清中促炎因子肿瘤坏死因子(TNFα)、γ干扰素(IFNγ)及抗炎因子白介素(IL10)的表达水平，并对miR146a与炎症因子的表达进行相关性研究。结果 AMI组和UA组患者miR146a基因表达明显高于SA组与CPS组(P<0.05)，而SA组和CPS组间差异无统计学意义(P>0.05)。ELISA结果显示，AMI组及UA组培养基上清中TNFα、IFNγ明显高于SA组及CPS组(P<0.01)，而IL10表达明显并无显著变化(P>0.05)。相关性研究发现，miR146a 的表达与TNFα、IFNγ浓度呈显著正相关(P<0.05)。结论 ACS患者miR146a表达明显增加，并与促炎因子表达呈正相关，提示miR146a功能亢进可能参与了ACS炎症反应过程，可能是动脉粥样硬化不稳定斑块的发病机制之一。
关键词：急性冠脉综合征；miR146a；炎症反应；动脉粥样硬化
中图分类号：R541.4 R256.2 文献标识码：B 文章编号：16721349(2012)08092303
目前多数学者认为动脉粥样硬化(AS)是在大、中动脉血管壁内皮细胞损伤后细胞免疫所接到的慢性炎症反应[1]。随着对动脉粥样硬化发病机制及危险因素的深入了解和积极控制，慢性心血管病的一级预防取得了令人鼓舞的进展，然而急性心血管事件(包括心脏性猝死和急性冠状动脉综合征)的预防及治疗仍缺乏有效的措施。近年研究发现，导致急性心血管病事件的主要原因是AS斑块的易损性，而炎症在易损斑块发生机制中的核心作用日益受到重视[2]。
MicroRNA是一组最近发现的内源性的非蛋白编码调控RNA，这些含有19个～23个核苷酸单链RNA可以通过与靶基因mRNA的3 ’UTRs不同程度的互补结合，以降解靶基因mRNA或抑制翻译两种方式调节生物体内基因的表达[3]。晚近研究提示，MicroRNA(miR146a)在T细胞、B细胞、单核细胞中均有表达，并与多种炎症因子及转录因子的活性有密切关系，在免疫反应中miR146a 可能发挥了精细的调控作用[4]。本研究通过对急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞内miR146a表达水平的检测及其与炎症因子相互关系的探讨，为miR146a在ACS中的基础研究奠定基础。
1 资料与方法
1.1 研究对象 2011年7月—2012年2月在我院住院及门诊随访的患者91例，其中急性心肌梗死(AMI)26例，不稳定型心绞痛(UA)25例，稳定型心绞痛(SA)22例，胸痛综合征(CPS)18例，所有患者均行冠状动脉造影检查。CPS组为胸痛但不伴有心电图改变和冠状动脉狭窄及痉挛[5]。
排除标准：合并严重的肝肾功能不全；心脏或其他部位的急、慢性炎症；合并脑卒中；恶性肿瘤；风湿性疾病；高热以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等。
1.2 研究方法
1.2.1 血样采集 AMI与UA患者均在发病24 h内从前臂周围静脉采取空腹血标本，SA组和CPS组于冠状动脉造影时采血3 mL,肝素钠抗凝。
1.2.2 Realtime PCR法检测miR146amRNA的表达 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)，用miReasy Mini Kit试剂盒提取<200bp RNA，每组设10 μL RT反应体系采用miScript Reverse Transcription Kit试剂盒进行逆转录反应，取5 μL cDNA模板采用the miScript Primer Assay 及the miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒进行PCR。miR146a扩增应用miScript通用引物及其特异性引物(5′ UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU3′ the miScript Primer Assay)，同时以5S作为内参(上述试剂盒均购自QIAGEN公司，所用操作步骤均按照说明书进行)，应用ABI7500实时定量PCR仪测定其相对表达量。
1.2.3 Northern blot法验证miR146amRNA表达 分别提取各组细胞总RNA各100 μg ,用8M尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶分离 ......
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