纤维蛋白胶对骨髓源性心肌干细胞增殖、迁移和缺血缺氧后的保护作用(2)
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Key words:fibrin glue；marrowderived cardiac stem cell；survival；migration
动物实验和初期临床研究已证实干细胞移植能够修复坏死心肌，并在一定程度上改善心功能[1]。然而，由于心肌梗死后局部缺血、缺氧和产生氧化应激，致使移植细胞在不利微环境内存活能力低下和不能有效地向心肌细胞分化，从而严重地影响了干细胞移植的治疗效果[2]。纤维蛋白胶(fibrin glue，FG)是纤维蛋白原在凝血酶的作用下形成的一种天然生物材料。FG不仅具有良好的生物相容性和生物可降解性，还可以通过降解产物纤维蛋白E片段诱导新血管形成[3]。FG可利用病人自身血液成分制备，能够避免免疫源性，已获得FDA批准并广泛应用于临床外科领域。FG承载骨骼肌成肌细胞或骨髓单个核细胞(BMMNC)等移植治疗心肌梗死，能够减少梗死面积，促进细胞存活和血管新生，有利于心功能的改善[47]。然而，并不能促进梗死部位的心肌再生，这可能与移植细胞很少甚至不能向心肌分化有关。由于骨髓源性心肌干细胞(marrowderived cardiac stem cell，MCSC)具有特异性心肌分化潜能[8,9]，应用FG承载MCSC移植治疗心肌梗死有望达到理想的治疗效果。因此，本文首次研究了FG对MCSC增殖、迁移和存活的作用，为临床应用干细胞移植治疗心肌梗死等缺血性疾病提供实验手段和理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料 SD大鼠由复旦大学实验动物中心提供；DMEM培养基、胰酶、多聚赖氨酸、荧光活性染料DiI、纤维蛋白酶和凝血酶均购自美国Sigma 公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；吖啶橙(acridine orange，AO)和溴乙啶(ethidium brimide，EB)购自华美生物工程公司；无糖DMEM购自美国Gibco公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自日本Diagnostic Chemicals公司。
1.2 方法
1.2.1 MCSC的培养 参考成熟的实验方法[8]。将成年雄性SD大鼠拉颈处死，在无菌条件下剔出双侧股骨和胫骨。切除骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，用含有肝素的PBS冲洗骨髓腔，收集冲洗液后离心。用DMEM培养液混悬沉淀细胞，均匀接种到培养瓶中。当细胞达到70%～80%汇合时，经胰酶消化后收集细胞。用添加15% FBS的DMEM充分混悬沉淀细胞，使细胞分散成单细胞悬液。显微镜下计数细胞后，将单细胞悬液用培养液稀释，以10倍等阶式稀释的方式将单细胞悬液稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1 mL稀释后的细胞悬液加入10 mL培养液，使最终细胞密度为10个/mL。将稀释好的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔150 μL，进行单细胞克隆培养。通过多能干细胞标志物ckit的免疫荧光标记和早期心肌形成转录因子Nkx 2.5的RTPCR 检测，筛选具有特异心肌分化潜能的MCSC。
1.2.2 FGMCSC的制备 取第8代MCSC，用PBS浸洗后，在37 ℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化1 min，收集细胞，离心(1 000 r/min，8 min)。弃去上清液，加入纤维蛋白原重新悬浮。然后将50 μL细胞悬液缓慢滴加至96孔培养板中，随即在含有细胞的纤维蛋白原液体上面滴加50 μL浓度为5 U/mL的凝血酶，轻轻回荡和倾斜培养板，使两者混匀，放入培养箱20 min使其完全胶化，形成FGMCSC混合物。加入含15% FBS的 DMEM进行培养。
1.2.3 细胞在不同浓度FG中的生长 FGMCSC的制备同1.2.2。实验分两组：高浓度FG组和低浓度FG组。高浓度FG组为20 mg/mL纤维蛋白原形成的FG；低浓度FG组为5 mg/mL纤维蛋白原形成的FG。通过AO/EB染色观察MCSC在不同浓度FG中的生长。取各组培养后7 d细胞，加入AO/EB染色液。在Olympus荧光显微镜下观察细胞形态和着色。选择合适浓度的FG用于后续实验。
1.2.4 细胞增殖实验 取第8代MCSC，在37 ℃下用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液消化1 min，收集细胞，离心(1 000 r/min，8 min)。吸取0.5 mL密度为2×105个/mL的细胞悬液，加入1.5 mL PBS，再加入4 μL DiI染料，在4 ℃条件下静置10 min。清洗未结合的DiI染料后，用5 mg/mL的纤维蛋白原悬浮细胞，在96孔培养板中制备FGMCSC。加入15% DMEM进行培养。实验重复3次，每孔随机选取5个视野，在培养后2 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d分别在荧光显微镜下计数红色荧光细胞数目。
1.2.5 细胞迁移实验 在损伤实验，制备FGMCSC，放入培养箱中放置 20 min，使其完全胶化，用刀片切除胶的一部分，加入15% DMEM进行培养。在培养后1 d、2 d和3 d分别在相差显微镜下观察从切除边缘向外迁移的细胞。
在迁移实验，制备FGMCSC ......
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