甘精胰岛素、地特胰岛素、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞PPARγ2mRNA表达的影响(1)
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摘要：目的 探讨人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素对体外培养3T3L1脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2)基因表达的影响及可能机制。方法 体外培养3T3L1前脂肪细胞，在分化培养液分别加入100 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L人、甘精、地特胰岛素培养10 d，用RTPCR检测脂肪细胞中PPARγ2 mRNA表达水平的变化。结果 在细胞分化的过程中，胰岛素浓度的增高促进PPARγ2的表达；相同浓度下，人胰岛素促进PPARγ2 mRNA表达最强，甘精胰岛素次之，地特胰岛素最弱。结论 胰岛素通过上调PPARγ2基因表达促进前脂肪细胞的分化，不同胰岛素促分化能力不同。
关键词：人胰岛素；甘精胰岛素；地特胰岛素；前脂肪细胞；PPARγ2
中图分类号：R329.2 R255.4 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)08097102
糖尿病及其并发症对靶器官(心、脑、肾等)的损伤，严重威胁着人类的健康和生活质量。良好的血糖控制能够显著减少和延缓糖尿病并发症的发生和发展。长效胰岛素类似物延长了作用时间，无明显峰值，个体内变异小，更好的模拟了正常胰岛素的分泌。胰岛素可以提高前脂肪细胞的分化率，在前脂肪细胞转化中起着相当重要的作用。脂肪细胞的体积增大、数量增多或两者同时存在可引起脂肪组织增加。研究表明，仅少量的体重降低即可能降低糖尿病患者罹患心血管疾病的风险。目前，对胰岛素类似物的对比研究大多以临床研究为主，而基础研究甚少。胰岛素与其类似物对脂肪细胞的影响是否相同呢？本研究采用甘精、地特两种长效胰岛素类似物和人胰岛素分别诱导体外3T3L1前脂肪细胞分化，检测PPARγ2 mRNA表达的变化，探讨胰岛素对PPARγ2 mRNA调节的机制。
1 材料与方法
1.1 主要实验用品与化学试剂 DMEM/F12(1∶1)培养基、胰蛋白酶购自Gibco公司；胎牛血清(FCS)购自杭州四季青生物有限公司；青霉素、链霉素购自华北制药股份有限公司；人胰岛素、3异丁基1甲基黄嘌呤(IBMX)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、地塞米松、二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素由甘李药业有限公司提供；细胞培养板购自Corning公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；RTPCR试剂盒购自Fermentas公司；Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)购自Roche公司；引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.2 实验方法
1.2.1 3T3L1前脂肪细胞的培养和诱导分化 将3T3L1前脂肪细胞接种于培养瓶中,用含有10% FCS的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养，48 h换液一次，待细胞融合生长后按1∶2传代，取同代的对数生长期细胞，将细胞按照5×104/mL接种于6孔培养板。待细胞达到90%贴壁后加入分化培养基，其中含胰岛素(每组分别含有人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素100 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L，另设对照组为10 nmol/L人胰岛素)，地塞米松250 nmol/L、T3 0.2 nmol/L、IBMX 0.5 mmol/L，前4 d用含IBMX的分化培养基，后6 d用不含IBMX的分化培养基。每天观察，隔48 h换液。10 d后超过90%的细胞成脂肪细胞表达。
1.2.2 RTPCR方法检测PPARγ2 mRNA的表达 用Trizol试剂裂解细胞提取总RNA逆转录为cDNA，逆转录反应条件参照试剂说明。PPARγ2 上游引物：5′CTCCTGTTGACCCAGAT3′，下游引物：5′AATGCGAGTGGTCTTCCATC3′,扩增片段长度：120 bp；内参基因GAPDH 上游引物：5′TGAACGGGAAGCTCACTGG3′，下游引物：5′TCCACCACCCTGTTGCTGGA3′，扩增片段长度：307 bp。PCR反应体系：cDNA 5.0 μL，FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)25.0 μL，上下游引物各0.5 μL，用DEPCH2O补足至50 μL体积。PCR反应条件：PPARγ2 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,40个循环。用Ct值表示目的基因的扩增长度，用2-△△Ct对mRNA水平进行相对定量分析。△△Ct=(△Ct目的基因-△Ct标准值)，其中△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct内参基因。实验重复3次，每组设3孔重复(N=3，n=3)。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，多组定量资料比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用LSDt检验。
2 结 果
2.1 相同胰岛素不同浓度对3T3L1脂肪细胞PPARγ2 mRNA表达的影响 以对照组(10 nmol/L)mRNA表达值为1。与对照组相比，三组PPARγ2 mRNA表达随胰岛素浓度的升高而增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素均可促进PPARγ2 mRNA的表达，在该实验浓度范围内，基因的表达随着浓度的增加而增加。详见表1。
2.2 相同浓度下不同胰岛素对3T3L1脂肪细胞PPARγ2 mRNA表达的影响 三组胰岛素间差异均有统计学意义(P<0 ......
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