HIF-1α及其抑制剂对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时神经细胞凋亡的影响(1)
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摘要：目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF1α) 及其抑制剂2甲氧基雌二醇(2ME2)对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时神经细胞凋亡的影响。方法 将120只新生7 d龄Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham组，n=8)、缺氧缺血模型组(HIBD组，n=56)、2ME2干预组(2ME2组，n=56)，后两组采用Rice法建立模型后，根据断头取脑的时间不同又分为3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和7 d7个亚组。应用HE染色观察脑组织的病理变化，免疫组化技术检测HIF1α、Bax、Bcl2的表达，TUNEL法计数脑细胞凋亡。结果 HE染色显示2ME2干预后脑组织的损伤减轻；免疫组化显示：HIF1α在HIBD组于模型制备后3 h升高，12 h达高峰，之后下降，2ME2组表达趋势和HIBD组相同，表达水平显著下降。与HIBD组比较，2ME2组各时间点的Bcl2表达显著升高，Bax表达显著降低， TUNEL标记的阳性细胞数明显减少。结论 在新生大鼠缺氧缺血急性期使用2ME2抑制HIF1α的表达，引起Bax/ Bcl2表达量比值降低，凋亡细胞数目减少，改善脑损伤。
关键词：缺氧缺血性脑损伤；缺氧诱导因子1α； 2甲氧基雌二醇； Bax；Bcl2； 细胞凋亡
中图分类号：R651 文献标识码：A 文章编号：16721349(2012)08097704
缺氧/缺血性脑损伤( hypoxiaischemia brain damage，HIBD)是新生儿时期最常见且严重的神经系统损伤，其发病机制至今不明，目前缺乏有效的治疗方法。缺氧诱导因子1α(HIF1α)是被低氧激活的核转录因子，可以通过调节其靶基因的表达促进或者抑制细胞凋亡[1,2]。有研究显示,抑制HIF1α的表达在脑缺血后的成年动物模型中产生神经保护作用[3,4]，但是HIF1α及其抑制物在新生动物模型中的作用目前国内外报道甚少，本实验应用HIF1α的抑制剂2甲氧基雌二醇(2ME2)作用于新生大鼠缺氧缺血模型，以期为新生儿缺氧缺血性脑损伤的发病机制阐明和治疗提供新思路和理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与药品 一抗(兔抗鼠HIF1α、Bax、Bcl2)和二抗(即用型SABC试剂盒)及TUNEL细胞凋亡检测试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。2ME2系美国Cayman公司提供,由于2ME2是脂溶性粉末物质，本实验采用二甲基亚砜(DMSO)溶解后，用PBS稀释使有毒物质DMSO的浓度降为5%，制成2ME2溶液。
1.2 动物分组及模型制备 120只清洁级、封闭群、新生7 d龄Wistar大鼠，体重11 g～15 g，雌雄不限，购自山西医科大学生理实验室动物房。随机分成假手术组(Sham组，n=8)、缺氧缺血模型组(HIBD组，n=56)、2ME2干预组(2ME2组，n=56)。后两组根据处死时间不同又分为7个亚组：3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d，每亚组各8只。Sham组给予麻醉后切开颈部皮肤，游离左侧颈总动脉后缝合皮肤；HIBD组给予麻醉后切开颈部皮肤，结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤后休息90 min，置于缺氧仓中(含8%氧气)2 h。2ME2组同HIBD组制作HIBD模型，各亚组在缺血缺氧后10 min给予一次性腹腔注射2ME2溶液(其中2ME2的含量为15 mg/kg)。Sham组、HIBD组仅给予等量的DMSO+PBS。
1.3 标本的制备 各组分别在模型制备后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和7 d处死各组动物，断头取左侧脑组织，10%多聚甲醛室温固定24 h，切块，石蜡包埋后，连续做冠状切片。
1.4 HE染色 常规石蜡切片→二甲苯脱蜡→梯度酒精脱水→苏木素、伊红染色→二甲苯透明→中性树胶封片→显微镜下观察。
1.5 免疫组化
1.5.1 HIF1α的检测 切片常规脱蜡至蒸馏水，至3%H2O2，室温孵育15 min，枸橼酸缓冲液高压热修复2 min，降温至室温，PBS液洗，加HIF1α的一抗(1∶150)，湿盒置于4 ℃冰箱内过夜，复温至室温，PBS液洗，加二抗，湿盒置于37 ℃恒温箱内孵育15 min，PBS液洗，DAB显色剂显色，自来水中终止，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。阴性对照切片用PBS液代替一抗，余步骤相同。
1.5.2 Bax、Bcl2的检测 用Bax、Bcl2的一抗代替HIF1α的一抗，稀释浓度热修复时间及余步骤与HIF1α的检测相同。
1.6 TUNEL计数细胞凋亡 严格按照试剂盒提供的实验步骤操作。
1.7 图像分析 采用BI2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)进行图像采集与分析，在相同光亮强度和放大倍数(10×40)条件下统计阳性细胞平均灰度值(无单位)，平均灰度值越高，阳性表达越弱，而平均灰度值越低，阳性表达越强。每只鼠3张片子，每张片子取4个视野，求其均数进行比较和分析。TUNEL计数：高倍镜下(×400)在缺血侧皮质区随机选取10个非重叠视野，计数500个细胞，计算阳性率即凋亡指数(AI) =阳性细胞数/观察细胞数×100%。
1.8 统计学处理 应用SPSS 13 ......
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