王建刚，田首元，凡浙录

    丙泊酚是常用静脉麻醉药，已广泛用于心血管手术麻醉[1]。既往研究表明，丙泊酚能够抑制心肌细胞凋亡而发挥心肌保护作用[2]。但其机制尚有待进一步明确。磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸激酶/内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)信号转导通路的激活参与介导缺血预处理减轻心肌缺血再灌注损伤的的作用[3]。丙泊酚的心肌细胞保护机制是否与PI3K-AkteNOS信号转导通路有关尚有待研究。本研究拟评估PI3KAkt-eNOS信号转导通路在丙泊酚减轻缺氧/复氧致乳鼠心肌细胞凋亡中的作用。

    1 材料与方法

    1.1 原代心肌细胞培养 取出生1d～3dWistar乳鼠，雌雄不限(山西医科大学动物中心提供)，75%酒精浸泡后，无菌条件下取其心脏置于预先盛有D-Hanks液的无菌平皿内，用含抗生素的D-Hanks灌冲洗两遍。取心室肌剪碎至1mm3～2 mm3大小的组织块，移入5 0mL离心管中，用适量预温的0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA 37℃水浴震荡分次消化，每次约8min，直至组织块完全消化。收集除第一次以外的单细胞悬液，放入含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，终止消化7目筛网过滤去除未消化的组织，在4℃时以1 000 r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，加入培养液(80%DMEM、20% 胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL和0.1mmol/L BrDU)混悬。台盼蓝染色计数，调整细胞数至5×106/L。接种到25mL培养瓶中，置37℃培养箱(含95%空气+5%CO2)中培养2h以纯化心肌细胞(差速贴壁法)。接种到24孔培养板中，每24h观察细胞贴壁及生长情况，并更换培养液。其中BrDU在细胞培养36h内加入以抑制非心肌细胞增殖。接种3d～4d后，用无血清的DMEM培养24h，使细胞周期同步化后行缺氧/复氧干预。

    1.2 心肌细胞缺氧/复氧损伤模型建立及实验分组 取上述原代培养6d～8d的整孔搏动的6组心肌细胞(每组10孔)。随机分为4组，参照Koyama[4]制备缺氧/复氧模型，并分为4组。Ⅰ组(对照组)：持续通以95%O2、5%CO2、37℃温育60min。Ⅱ组(单纯纯氧/复氧组)：持续通以95%N2、5%CO2、37℃温育40min ......