李思敏，杨 静

    近来糖尿病被认为是一种慢性低度促炎症状态，表现为循环中的单核细胞及炎症因子水平升高，并且认为细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)与糖尿病动脉粥样硬化及心脑血管疾病有着密切联系[1]。很多实验表明高糖可以引起体内细胞因子水平的变化，但是在高糖环境下细胞因子的浓度如何变化，不同的研究结果不尽一致。有研究表明糖尿病患者血中免疫细胞分泌的Th1型细胞因子[如干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)]浓度比正常糖浓度者血中免疫细胞分泌的 Th1型细胞因子浓度高，而Th2型细胞因子(如IL-4、IL-10)的浓度是降低的[2]。但也有研究表明1型糖尿病(TIDM)患者外周血中的CD4+、CD8+T细胞产生的IFN-γ与正常糖浓度者相比是显著降低的[3]。而有关小鼠脾细胞的研究报道较少，本实验采用体外培养小鼠脾细胞，以不同糖浓度刺激，检测细胞因子的表达情况，探求高糖环境对免疫细胞功能的影响。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料及试剂 C57BL/6雌性清洁级小鼠(6周龄)购自北京大学医学部-北京华阜康生物科技股份有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、谷氨酰胺及青霉素、链霉素购自美国 GIBCO公司；HEPES、D-葡萄糖、PMA、Ionomycin、脂多糖(LPS)及刀豆凝集素(ConA)购自美国SIGMA公司；CytoTox 96?非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国PROMEGA公司；ELISA检测试剂盒与流式细胞术检测试剂盒均购自美国BD公司。

    1.2 分离小鼠脾细胞 颈椎脱臼法处死小鼠，用75%酒精消毒腹部皮肤及四肢，无菌条件下剖开小鼠腹腔取出脾脏，置于不含FBS的RPMI 1640培养基中，并去除周围结缔组织，待所有脾脏均取出后，用2.5mL注射器内芯通过40μm细胞过滤网研磨，收集细胞悬液于15mL离心管中，并加入含5%FBS的RPMI 1640培养基将细胞吹打混匀，离心后裂解红细胞并用RPMI 1640培养基清洗2遍，最后细胞重悬于RPMI 1640无糖培养基中。

    1.3 细胞培养及实验分组 调整细胞浓度为3×106/mL，培养于含5%FBS、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素及25mmol/L HEPES的RPMI 1640培养基中，加入LPS(1μg/mL)及ConA(5μg/mL)为刺激T、B淋巴细胞增殖 ......