梅金平,周 欣,姬文婕,马永强,杨国红,郭兆增,李玉明,赵季红

    ·基础医学论著////研究·

    基于流式细胞术的小鼠血小板聚集率检测方法评价及川芎嗪的干预作用

    梅金平1,周 欣2,姬文婕2,马永强2,杨国红2,郭兆增2,李玉明2,赵季红2

    目的评价一种新的基于流式细胞术(Flow cytom etry,FCM)小鼠血小板聚集活性检测方法,以及川芎嗪的干预作用。方法CD61-PE和CD61-FITC标记的小鼠血小板(n=5)混合后加入ADP(终浓度20μmol/L)诱导血小板聚集,同时标记两种荧光染料的细胞群占所有血小板的百分比来评估血小板聚集功能;16只雄性C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水组和氯吡格雷组, FCM检测小鼠血小板聚集功能;FCM检测川芎嗪(TMPZ)低、中、高浓度(终浓度分别为0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml)和替罗非班(终浓度为5μg/ml)对小鼠血小板聚集功能的影响。结果经ADP(终浓度20μmo l/L)诱导激活后含有双色荧光标记的细胞群即血小板聚集体明显增多(P1 材料与方法

    1.1 材料 SPF级C57BL/6J小鼠,体质量为20 g～ 30 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司;二磷酸腺苷(Adenosine acid,ADP,Sigma公司,美国);流式抗体:抗CD61-FITC、抗CD61-PE(Bio legend公司,美国);盐酸川芎嗪(哈尔滨三联药业有限公司);注射用盐酸替罗非班(山东新时代药业有限公司);硫酸氢氯吡格雷[75 mg,赛诺非安万特(杭州)制药有限公司];HEPES/tyrode’s bu ffe r、酸性柠檬酸葡萄糖溶液B(ACD),参照相关文献配制[7];红细胞裂解液(1× RBC美国);流式细胞仪FC 500(美国);振荡混匀器(IKA公司,德国)。

    1.2 方法

    1.2.1 流式细胞术检测小鼠血小板聚集率 按照每40μL全血加入ACD 40μL,HEPES/tyrode’s bu ffer 80μL的比例制备全血稀释液;C57BL/6J小鼠(n=5)通过颌下静脉丛取血,静脉血滴入EP管后迅速用微量移液器取出40μL。将稀释的全血等分成4份,分别加入标记为T1、T2、T3、T4的EP管,T1、T3管中分别各加入CD61-PE 0.24μL+cell staining bu ffer 5 μL,T2、T4管中分别各加入CD61-FITC 0.24μL+ cell staining bu ffer 5μL,室温避光孵育15 min;将T1、T2中的样品加入标记为F1的EP管中(作为基线组);T3、T4中的样品加标记为F2的EP管中 ......