王秋艳,牛小媛,胡林森,房亚兰

    蛋白酶体抑制剂诱导的PD 细胞模型中p47表达及磷酸化水平研究

    王秋艳1,牛小媛1,胡林森2,房亚兰1

    目的探讨蛋白酶体抑制剂(PSI)作用于PC12细胞后细胞总蛋白及其磷酸化水平的变化。方法收集实验组(PSI,10 μmol/L)和对照组[二甲基亚砜(DMSO)]细胞总蛋白,进行双向电泳,应用Pro-Q Diamond磷酸化蛋白凝胶染色技术获得蛋白点磷酸化水平的差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果差异蛋白点2、3均为p47,为2个同功体,蛋白酶体抑制剂干预后二者磷酸化水平均增加。结论p47表达上调及磷酸化水平增高与蛋白酶体抑制剂诱导的异常蛋白聚集及空泡形成有关,p47可能参与帕金森病的发病机制。

    蛋白酶体抑制;PC12细胞;p47;磷酸化

    帕金森病(Parkinson disease,PD)是最常见的神经变性疾病之一,迄今为止PD的病因和发病机制还不完全清楚。近年来研究表明家族性和散发PD都与泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)功能障碍有关[1]。经典的PD模型[包括6-羟基多巴胺(6-OHDA)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)/1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)、百草枯、鱼藤酮模型]中也存在UPS功能障碍。应用蛋白酶体抑制剂已成功地建立了新的PD细胞和动物模型[2-4]。

    蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的一种共价修饰方式,在许多生物效应中起着开/关的作用。据估计,真核细胞的蛋白质分子中约有1/3发生磷酸化修饰。新近推出的Pro-Q Diamond磷酸化蛋白染色技术适用于包括磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸以及磷酸酪氨酸的蛋白分子的定量荧光检测,且可直接在凝胶上进行,与MALDI-TOF-MS兼容,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能[5,6]。

    目前关于泛素-蛋白酶体功能障碍与PD的关系还不完全清楚,本研究应用蛋白酶体抑制剂作用于PC12细胞建立PD细胞模型,应用蛋白质组学和磷酸化亚蛋白质组技术,以期发现可能与PD相关的异常磷酸化蛋白。

    1 材料与方法

    1.1 材料来源 PC12细胞购自中科院上海细胞库。蛋白酶体抑制剂(proteasome inhibitor 1,PSI)购自Merck公司 ......