敖 锋 ，张自力 ，宋 健

    ·基础医学论著/研究·

    大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定

    敖 锋1，2，张自力1，宋 健2

    目的 探讨一种方便、快捷、大量原代培养大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的方法，为心血管疾病的体外研究提供可靠的实验材料。方法 利用改良的组织贴块法进行血管壁中膜平滑肌细胞原代培养，使用倒置相差显微镜观察细胞形态，并用免疫荧光染色鉴定分离培养的细胞。结果 改良的组织贴块法成功培养出大鼠血管壁中膜平滑肌细胞，3 d～5 d可见细胞爬出，7 d～9 d即可传代。镜下见细胞以长梭形为主，呈典型“峰-谷”样生长，免疫荧光染色鉴定阳性细胞率在95%以上。结论 本研究介绍的改良组织贴块法技术成熟，具有操作简单、方便等优点，使用该法不仅可以获得纯度高、活性好的血管中膜平滑肌细胞，而且缩短了培养周期。

    血管壁；中膜；平滑肌细胞；原代培养

    血管壁中膜平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)是构成血管壁组织结构和维持血管张力的重要成分之一，而SMC发生表型转换、迁移、异常增殖并分泌大量细胞外基质所引起的内膜增厚是高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等心血管疾病的核心病理过程[1-2]。因此，研究中膜SMC增殖、迁移的信号转导机制及寻找动脉粥样硬化等疾病的分子治疗靶点是当前心血管界的热点和难点[3]，而SMC的原代培养为进行心血管疾病的分子生物学机制体外研究、相关药理研究提供了有利的实验材料。笔者在对国内外同行研究深入分析的基础上对传统SMC培养方法组织贴块法进行改进，通过反复实践摸索建立出稳定、快捷、方便、高效的大鼠中膜SMC体外培养模型，并采用免疫细胞化学染色对其鉴定，纯度在95%以上。现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 清洁级健康SD雌性大鼠，(2～3)月龄，体重150 g～200 g，由武汉大学医学部实验动物中心提供。

    1.2 主要试剂 DMEM/F-12液体培养基(Gibco公司)、青霉素(Amresco公司)、链霉素(Amresco公司)、Ⅱ型胶原酶(Worthington Biochemical公司)、β-巯基乙醇(Sigma公司)、谷氨酰胺(Thermo公司)、炭吸附特级胎牛血清(Biological Industries公司)、兔抗平滑肌肌球蛋白重链抗体(Abcam公司)、Hoechst(Sigma公司)、FITC标记的山羊抗兔IgG抗体(Beyotime公司)等均通过商品化途径购置。

    1.3 SMC的原代培养 按0.25 mL/100 g腹腔注射2%戊巴比妥钠 ......