曲 哲，刘 佩，姚 园

    MMP-9在心肌缺血再灌注中的作用和机制研究

    曲哲，刘佩，姚园

    武汉大学人民医院(湖北武汉 430060)，E-mail：yinh74@126.com

    摘要：目的探讨血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在心肌缺血再灌注中的表达和作用机制。方法建立大鼠急性心肌缺血再灌注模型，构建MMP-9 siRNA慢病毒，并分为对照组、缺血再灌注(I/R)组、I/R+control-siRNA组、 I/R+MMP-9-siRNA组。观察并记录术后28 d各组大鼠生存情况，Western Blot 检测在大鼠 I/R术后1 d，7 d，14 d，28 d心肌中MMP-9的表达；M型超声评价各组大鼠心功能改变；Real time PCR法检测干扰素-γ(IFN-γ)、 白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化。结果I/R+ MMP-9 siRNA组大鼠生存率达80%，生存率显著提高，与I/R组比较，具有统计学意义(P1/2 R波)呈单峰曲线作为模型成功标志。结扎45 min后，去除塑料管，撤除结扎线。以心肌恢复红润且ST 段下降作为再灌注模型成功标志。

    1.3.3MMP-9 siRNA慢病毒构建及包装针对基质金属蛋白酶8靶基因设计siRNA序列，序列由Santa Cruz合成，序列号sc-35950，由3个靶向特异性的含20～25碱基的siRNA构成；control siRNA是非靶向20～25 nt siRNA，序列号 sc-37007。合成小发卡RNA(short hairpin RNA，siRNA)结构的DNA，与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞，构建成携带MMP-9-siRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-siRNA)，PCR及测序鉴定后，Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体，并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP8-siRNA慢病毒，并测定病毒滴度为1×1010pfu/L。PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶8短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体，表明实验成功构建基质金属蛋白酶8的RNA干扰慢病毒表达载体。

    1.3.4Western blot检测MMP-9蛋白表达变化Western Blot 检测在大鼠 I/R术后1 d，7 d，14 d，28 d心肌中MMP-9的表达。取心肌提取蛋白：加裂解液，在冰上裂解并研磨15 min～30 min ......