范少平，丁文学，梁碧先

    葛根素对HIE新生大鼠神经及PI3KAkt信号通路的作用机制研究

    范少平，丁文学，梁碧先

    目的 观察葛根素对缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)新生大鼠的神经保护作用，分析神经保护作用是否涉及PI3K/Akt 信号通路的参与以及可能的机制。方法 90只新生7 日龄Wistar 大鼠随机分为假手术组(n=10)、HIE 组(n=40)及葛根素疗组(n=40)，后两组又进一步分为3 h、6 h、12 h、24 h 4 个时间点，每个时间点10 只。参照Rice 等和吴婉芳法，建立新生大鼠HIE 模型。HE 染色观察各组大鼠神经元形态变化，免疫组织化学法检测磷酸化Akt 的表达。依据免疫组化的结果采用Western blot 方法进一步检测PI3K/Akt 信号通路表达。结果 90只Wistar大鼠模型全部成功，全部纳入结果分析。HE 染色示葛根素治疗组大鼠大脑皮层和海马区神经细胞坏死率较HIE 组明显减少。免疫组化结果示：随着时间的延长，葛根素治疗组磷酸化Akt 蛋白阳性率较HIE 组显著上调(P1 材料与方法

    1.1 实验材料 动物：SPF级7日龄(以出生日计算为0天)，Wistar大鼠购自我院实验动物研究中心，雌雄不限，营养中等，体重19 g～21 g，共90只。在模型制备后及观察阶段放回饲养笼，在自然状态下由母鼠哺乳喂养，保持适宜的光照，室温和空气湿度等。

    主要试剂：葛根素购自山东省烟台鲁银药业有限公司。磷酸化Akt 一抗，免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德公司(用于免疫组化)。磷酸化Akt 信号通路试剂盒购自美国NeoMarkers 公司(用于western blot 检测总Akt、磷酸化AktSer473、磷酸化AktThr308)。鼠抗β-actin单克隆抗体购自sigama公司。硝酸纤维素膜购自Sigama公司。Tris Base、溴酚蓝、NP40、Tris-Hcl、脱氧胆酸钠、SDS、甘氨酸、过磷酸胺、DTT、四甲基乙二胺、TWEEN20购自Sigama公司。甲醇为国产分析纯。脱脂奶粉市售。氧气由我院提供，氮气购自武汉造船厂，自行配制8%氧气和92%氮气混合气体。其他：乙醚、5%水合氯醛、4%多聚甲醛、眼科剪、组织剪、纱布、丝线、显微镜等均由我院实验动物中心实验室提供。

    仪器和设备：便携式数字测氧仪：上海第三分析仪器厂。自制常压缺氧舱：直径为40 cm，高60 cm 的圆柱形透明塑料容器 ......