连 霞，李光来，李东芳，薛国芳，裴宇恒

    多效生长因子在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的表达变化

    连 霞，李光来，李东芳，薛国芳，裴宇恒

    目的 探讨多效生长因子(PTN)在体外诱导成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化中过程不同时间的表达变化，了解多效生长因子是否参与BMSCs向神经元样细胞分化的机制。方法 以密度梯度离心加贴壁培养法分离成人BMSCs，进行原代和传代培养，以流式细胞仪鉴定纯度。对照组和实验组对传代第6代的BMSCs进行诱导分化，诱导后30 min至3 d，观察细胞形态并计数。将分化后细胞采用免疫细胞化学法测定神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达。对诱导前和诱导后3 h、6 h、12 h、24 h、3 d细胞以RT-PCR法测定PTN mRNA表达。结果 BMSCs在接种1 d后黏附贴壁，呈椭圆形或圆形，3 d～5 d后呈梭状细胞成簇生长，7 d～12 d融合。传代至第5代～6代可见较为均一的成纤维细胞样形态。流式细胞仪检测结果显示：细胞表达CD44、CD105，不表达造血干细胞的特异标记CD45，证实其纯度。诱导后细胞胞体开始向细胞胞核收缩，出现双极或多极细胞。12 h变形细胞增多，细长突起相互连接。24 h后细胞变化不明显。诱导后细胞经免疫化学染色显示：多数表达NSE(64.79±0.06)%、MAP-2(60.05±0.09)%，而未检测到GFAP。实验组诱导后细胞不同时间点PTN mRNA的表达不同(P1 材料与方法

    1.1 实验材料 骨髓采集于健康成年志愿捐髓者；DMEM培养基(Gibicol公司)；胎牛血清(FBS)(杭州四季青公司)；BHA(中国药物试剂公司)；BME、二甲基亚砜(DMSO)、胰酶(AMRESCO公司)；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)、兔抗人神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、羊抗兔二抗、链霉素和素-生物素复合物(SABC)试剂盒(博士德公司)；寡核苷酸引物序列(大连宝生物有限公司合成)；RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(TKaRa公司)；CO2培养箱、倒置荧光显微镜、超静工作台、流式细胞仪(Kurtz公司)；Kodark凝胶数字扫描分析系统等；PTC-100型PCR仪。

    1.2 BMSCs分离培养 以髂后上棘行骨髓穿刺术抽取4 mL肝素化骨髓，加胎牛血清制成悬液，离心弃上清去除脂肪 ......