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    下调大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素转换酶的表达

    周华，张翠芳，陈瑞瑞，高奋，杨志明

    目的构建腺病毒载体使其携带血管紧张素转换酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA)，观察选择性下调大鼠血管平滑肌细胞ACE表达。方法从之前构建的真核表达载体p-ACE-shRNA中扩增ACE-shRNA片段，采用RT-PCR法并克隆进穿梭质粒pDC316中，将构建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭质粒载体和pBHGlox-E1，3Cre骨架病毒共转染293细胞，进行病毒颗粒包装重组、滴度测定和纯化。随后进行原代培养大鼠血管平滑肌细胞转染，通过实时荧光定量PCR分别在转染前及转染后24 h、48 h、72 h检测ACE mRNA的表达。结果经PCR检测证实携带ACE-shRNA重组腺病毒载体构建成功并制备出了高滴度重组病毒，大鼠血管平滑肌细胞被转染后24 h，ACE mRNA表达无明显变化；被转染后48 h，ACE mPNA表达显著降低，差异有统计学意义(P1 材料与方法

    1.1 主要材料 先期由本研究小组构建完成的质粒

    p-ACE-shRNA，人源U6启动子与增强绿色荧光蛋白(EGFP)序列，内含靶向大鼠ACE shRNA片段、两个限制性内切酶位点Sac1和EcoR1之间克隆的质粒pGenesil-1。腺病毒包装系统AdMax同时包括穿梭质粒pDC316-EGFP-shRNA-U6、腺病毒骨架质粒pBHGlox-E1，3Cre与HEK- 293细胞(北京本元正阳基因技术公司)。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、RNase A(TaKaRa)。PCR产物回收纯化试剂盒(宁波中鼎生物技术有限公司)与转染试剂Lipofectamine2000(Gibco)。DMEM、F12培养基 (Gibco)、质粒提取试剂盒(QIAGEN)、氯化铯(Sigma)、胎牛血清(Hyclone)。超绝总RNA抽提试剂盒含UNIQ-10柱(上海生工生物工程技术有限公司)。其他各种试剂均为国产或进口分析纯试剂。探针、引物的合成与设计均由上海基康生物技术工程有限公司完成。

    1.2 目的基因获取 取1 μL p-ACE-shRNA质粒用热休克法转化入DH-5α感受态大肠杆菌，挑取一单克隆，接入LB培养基5 mL，37 ℃振荡培养18 h，取菌液3 mL提取质粒。在HindⅢ限制酶和BamHI限制酶的作用下，水浴37 ℃酶切过夜。1%琼脂糖凝胶进行酶切产物电泳，取酶切产物5 μL和1 mL 6×Loading Buffer 混匀上样 ......