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    SPAK参与药物抗性癫痫小鼠海马神经元GABA信号的功能重塑

    杨丽白1，蔡晓冬2，周列民3，牛争平4，李新毅1

    目的研究氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫(PISE)小鼠海马神经元生理生化的变化，探讨药物抗性癫痫的γ-氨基丁酸(GABA)信号功能的重塑机制。方法将4周～6周健康雄性Balb/c小鼠制作成PISE癫痫模型，动物随机分为3组：癫痫模型组、假模型组和空白组，造模后观察1d(静息期)、14d(亚急性期)、45d(慢性自发癫痫发作期)三个时间点，每组每个时间点各6只动物。采用免疫双标观察201S1相关的氨酸/丙氨酸激酶/Na+-K+-2Cl-共转运体1(NKCC1)、SPAK/K+-2Cl-共转运体2(KCC2)在海马组织共表达情况。WesternBlot检测各组小鼠海马组织SPAK蛋白表达的差异。用Cl-荧光探针MQAE检测各组神经元Cl-分布情况。免疫共沉淀法检测SPAK与NKCC1、KCC2是否存在相互作用。结果SPAK/NKCC1、SPAK/KCC2在小鼠海马组织共表达。与空白对照组及假模型组比较，模型组在PISE后1d、14d、45d海马组织SPAK表达均增高，差异有统计学意义(P1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 实验动物 健康成年雄性Balb/c小鼠54只，鼠龄6周～8周，体重18g～22g。由中山大学北校区动物中心提供。

    1.1.2 实验试剂 动物模型所需试剂：氯化锂(L9650-100g，Sigma-Aldrich公司)，丁溴东莨菪碱(S8502-1g，Sigma-Aldrich)，匹罗卡品(P6503-10G，Sigma-Aldrich公司)，安定(D9900，Sigma-Aldrich)。

    免疫组化试剂：兔抗小鼠SPAK多克隆抗体(AP7968c，Abgent公司)，山羊抗小鼠NKCC1多克隆抗体(sc-21547，Santa公司)，山羊抗小鼠KCC2多克隆抗体(sc-19420，Santa公司)，FITC标记山羊抗兔二抗(AP132F，Chemicon公司)，Cy3标记驴抗山羊二抗(SA0009-3，ProteintechGroup公司)。

    WesternBlot及免疫沉淀试剂：蛋白裂解液(#K0301，Fermentas)，兔抗小鼠SPAK多克隆抗体(AP7968c，Abgent公司)，免疫沉淀琼脂糖珠(sc-2336，Santa公司)，β-actin单克隆抗体(Mab1445，Sigma-Aldrich公司)，辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)(00001-1 ......