王 衡，陈 蓉，白瑞瑞，于奇晋，姜 进，李定安

    脑梗死是危害人类健康的重要原因之一，而神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖及分化在脑梗死等缺血性脑血管疾病中发挥重要作用，缺氧时间的延长可促进NSCs凋亡[1]。目前关于NSCs在缺氧中的作用机制尚未阐明。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在神经系发育过程中发挥重要调控作用，研究表明LncRNA可调控神经细胞分化过程[2-4]。LncRNA母系表达基因3(LncRNA MEG3)在神经细胞缺血缺氧模型中表达升高，母系表达基因3(MEG3)可促进缺血缺氧造成的小鼠神经母细胞瘤细胞凋亡[5]。但MEG3对小鼠脑梗死缺氧神经干细胞损伤的影响尚未可知。生物信息学分析显示微小RNA-455(microRNA-455，miR-455)可能是MEG3的靶基因，研究表明，miR-455在氧糖剥夺神经细胞和大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠脑组织中呈低表达，并可抑制缺血性脑卒中的神经细胞凋亡[6]。相关报道指出，磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)信号通路可能与脑梗死大鼠脑损伤、血管新生和氧化应激有关[7]。本研究通过构建MCAO小鼠模型，观察MEG3、miR-455在MCAO模型中的表达水平，原代分离与培养NSCs并进行缺氧处理构建NSCs缺氧损伤模型，检测细胞中MEG3与miR-455的表达水平，探究MEG3表达变化对NSCs增殖、分化、凋亡及氧化应激的影响，初步分析其对miR-455及PI3K/Akt信号通路的调控作用，以揭示NSCs缺氧损伤机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级健康雄性C57BL/6小鼠36只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物许可证号为SCXK(沪)：2016-0003。

    1.2 实验材料 杜氏改良培养基(DMEM)、胎牛血清购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司；Lipofectamine2000与Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；MEG3小干扰RNA(si-MEG3)、乱序无意义阴性对照(si-con)、miR-455模拟物(mimics)、阴性对照(miR-con)、miR-455特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-455)及其阴性对照(anti-miR-con)购自广州锐博生物科技有限公司；PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002购自美国Sigma公司；甲基噻唑基四唑(MTT)购自北京百奥莱博科技有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠CyclinD1、p21抗体购自上海善然生物科技有限公司；兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)抗体购自美国Abcam公司；兔抗鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Ⅲ型β微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)抗体购自北京百奥莱博科技有限公司；兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶 B(p-AKT)购自美国GeneTex公司；兔抗鼠PI3K、Akt抗体购自美国Epitmics公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自武汉艾美捷科技有限公司；RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒、增强型化学发光试剂(ECL)、二烷基硫酸钠(SDS)购自北京全式金生物技术有限公司 ......