李 悦,郝艳丽,吴 涛

    心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤是一种常见的心血管疾病,其特征为心肌组织血液供应减少,血液供应恢复导致缺血组织的继发性损伤[1]。目前,I/R损伤是导致缺血性心脏病病人高死亡率的重要原因。I/R损伤机制复杂,其中细胞内过度的氧化应激反应与细胞凋亡相关,对心肌组织损伤细胞的结构和功能有直接影响[2]。因此,提高心肌细胞抗氧化反应能力、减轻细胞凋亡可能是预防I/R损伤的有效方法。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200个核苷酸的新型非编码RNA,其通过在表观遗传、转录和转录后水平调控基因表达,参与自噬、氧化应激损伤、凋亡等多种病理过程[3-5]。研究表明,神经元细胞HT-22糖氧剥夺损伤模型中lncRNA横纹肌肉瘤相关转录物-2(rhabdomyosarcoma 2-associated transcript,RMST)表达上调,抑制lncRNA RMST表达可提高HT-22细胞存活率,减轻糖氧剥夺诱导的细胞凋亡[6]。lncRNA RMST表达下调还可抑制小胶质细胞活化,降低炎症反应,减轻神经元细胞损伤[7]。序列分析发现,miR-224-3p含有lncRNA RMST结合位点,miR-224-3p可抑制糖氧剥夺诱导的原代神经元细胞氧化应激损伤和凋亡,对脑I/R损伤具有保护作用[8]。然而lncRNA RMST、miR-224-3p在心肌细胞I/R损伤中的作用机制尚不明确。因此,本研究建立缺氧复氧(H/R)细胞模型,探讨lncRNA RMST和miR-224-3p在心肌损伤中的作用,以期为防治心肌I/R损伤提供新的方向。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂 人心肌细胞株(HCM)购于中国科学院上海细胞库;DMEM培养液、Lipofectamine 3000、TRizol试剂、miRNA逆转录试剂盒购于美国Invitrogen公司;胎牛血清购于杭州四季青公司;青链霉素双抗溶液、丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)活性检测试剂盒购于北京索莱宝生物科技公司;miR-224-3p模拟物(miR-224-3p mimics)、模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-224-3p抑制物(anti-miR-224-3p)、抑制物阴性对照(anti-miR-NC)、RMST小干扰RNA(si-RMST)、阴性对照序列(si-NC)以及双荧光素酶报告载体均由上海吉玛制药公司提供;逆转录酶、2×SYBR Green master mix购于大连Takara生物公司;膜联蛋白-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)购于上海钰博生物公司;兔B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma -2,Bcl-2)多克隆抗体、兔Bcl相关X蛋白(Bcl associated X protein,Bax)单克隆抗体、兔磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于上海碧云天生物公司 ......