牟寒霜,黄 震,郭 婧

    心肌肥大主要是心脏对各种应激的生理代偿性反应,表现为收缩蛋白表达增加和心肌细胞体积增大。尽管近年来在心肌肥大功能方面的研究取得了较大进展,但潜在的分子机制仍不明确[1]。越来越多的研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)在很大程度上与多种人类疾病的发生和发展有关,包括心肌肥大[2-3]。miRNA是一类非编码RNA,长度为20～25个核苷酸,其主要在转录后水平上发挥翻译抑制作用或使mRNA降解以调节基因表达并影响多种病理生理过程。有研究显示,miR-499a-5p在心肌缺血再灌注损伤和急性心肌梗死中发挥重要作用[4-5]。miR-499a-5p可能是介导心脏功能的关键调节剂[6]。然而,miR-499a-5p在心肌肥大中的作用尚不明确。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A)属于Cip/Kip家族,在细胞周期进程中发挥重要作用。研究报道,CDKN1A的过度表达能够促进细胞逃避细胞周期阻滞、衰老和凋亡[7];且CDKN1A与病毒性心肌炎、心肌发育以及肥厚型心肌病相关[8]。本研究探讨miR-499a-5p在心肌肥大中的作用及潜在机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料 大鼠心肌细胞H9c2(美国HyClone公司);DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);细胞计数试剂盒(CCK-8)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)(美国Sigma公司);CDKN1A、Cleaved Caspase-3、心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)单抗及二抗(美国CST公司);AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(大连宝生物工程有限公司);TRIzol试剂、逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂盒(赛默飞世尔);miR-499a-5p mimics和mimics control(上海吉玛制药)。细胞培养箱(美国Thermo公司);流式细胞仪(美国Becton Dickinson);荧光显微镜(日本Olympus公司)。双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京全式金生物)。

    1.2 H9c2细胞培养 心肌细胞H9c2培养于DMEM培养基(含10%胎牛血清)中,于5% CO2、37 ℃培养箱中培养,每隔1～2 d更换1次新的培养液。待H9c2细胞生长到80%以上时加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞,采用胰蛋白酶消化并传代培养。 ......