秦富吉,李妮妮,邹延新,李凤林

    急性心肌梗死是导致心血管疾病死亡的主要原因,随着冠状动脉介入等再灌注策略在临床的广泛运用,可最大限度地挽救缺血心肌,但恢复冠状动脉血流往往对心肌造成二次损伤,即心肌缺血再灌注损伤,其中氧化应激在缺血再灌注损伤的发病机制中起着非常重要的作用[1-2]。近年来研究发现,miR-141-3p可通过调节心肌细胞存活及凋亡等相关基因改善心肌缺血再灌注损伤,刘大朋等[3]研究发现,脂多糖诱导的心肌细胞中miR-141-3p表达水平明显降低,miR-141-3p可调控Krupec-6(KLF6)的表达影响心肌细胞炎症反应和凋亡。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)是Kelch家族中的一员,生理状态下与Nrf2形成“门闩-铰链”结构。活性氧(ROS)介导的氧化应激可使Keap1构象发生变化而与Nrf2解离,Nrf2不能继续被泛素化降解,继而转位至细胞核发挥转录活性,激活下游通路发挥抗氧化作用,因此,Keap1在Nrf2/血红素氧合酶1(HO-1)抗氧化应激通路中发挥重要的负性调控作用[4]。本研究通过生物信息学分析显示,Keap1是miR-141-3p的潜在靶基因,但miR-141-3p能否靶向Keap1参与对缺血再灌注心肌细胞凋亡和氧化应激的调控有待阐明。本研究通过建立缺氧/复氧(H/R)H9c2心肌细胞模型,探讨miR-141-3p靶向Keap1对H/R诱导心肌细胞凋亡、氧化应激的分子机制及对制及对Nrf2/HO-1通路的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料 大鼠心肌细胞H9c2购自美国细胞培养物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)细胞库,V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒、细胞毒性试验(CCK-8)试剂盒、ROS染液、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自碧云天生物技术有限公司,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司,SYBR Green PCR试剂盒购自Thermo公司,逆转录试剂盒购自Fermentas,Lipofectamine 2000试剂购自美国Thermofisher公司,miR-141-3p mimics、miR-NC、Keap1-野生型(WT)质粒和Keap1-突变型(MUT)质粒均购自广州锐博生物科技有限公司,Keap1、Nrf2和HO-1抗体由Proteintech提供,蛋白印迹电泳仪购自美国BIO-RAD公司,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(ABI 7500) ......