付 群,李长新,王 佳,宋 昕

    隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)是由严重的真菌感染而引发的疾病,通过血源性扩散从原发性肺病灶扩散至大脑,该疾病常见于细胞介导的免疫功能低下人群,具有极高的发病率和死亡率,因此,α详细了解其治疗药物对该疾病的治疗机制十分必要[1-3]。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎性小体可通过响应微生物感染和细胞损伤,激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1),并介导促炎细胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌,是先天免疫系统的重要组成部分,其异常激活与炎症性疾病密切有关[4]。有研究表明,新生隐球菌可依赖于钾离子外流和吞噬溶酶体膜的渗漏激活炎性小体,而抑制NLRP3炎性小体的激活可有效改善隐球菌性脑膜炎造成的脑损伤[5]。氟康唑(fluconazole)是一种唑类药物,具有有效的抗真菌活性,能够高效率穿过血脑屏障,已被用于治疗隐球菌性脑膜炎[6]。目前,关于氟康唑的研究多与临床相关,而关于其对隐球性菌脑膜炎的治疗机制是否与NLRP3炎性小体有关尚未明确。因此,本研究通过构建隐球菌性脑膜炎小鼠模型,探究氟康唑是否可通过调控NLRP3炎性小体通路影响隐球菌性脑膜炎小鼠脑小胶质细胞的激活。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 健康的雄性C57BL/6小鼠100只,体质量15～22 g,购自华中科技大学动物实验中心,许可证号:SCXK(鄂)2016—0009,于12 h/12 h正常明暗交替、相对湿度40%～70%的环境中适应性饲养7 d,期间自由采食、饮水。动物实验符合国家伦理准则及实验室动物护理及使用方针,且实验过程中严格进行质量控制。

    1.2 细菌培养 于沙保斜面培养基中接种隐球菌菌株后,在35 ℃、5% CO2培养箱培养3 d,生理盐水冲洗后将悬浮液调整为4.8×105cfu/mL。

    1.3 主要试剂及仪器 隐球菌菌株购自上海医学真菌实验室;肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(货号:CSB-EQ023955MO-1、CSB-E04639m-1、E-EL-M0046km)购自上海恒斐生物科技有限公司;氟康唑标准品(纯度:99%,规格:5 g,货号:K0040)购自上海宝曼生物科技有限公司;注射用两性霉素B(规格:每支25 mg,国药准字H13020284)购自华北制药股份有限公司;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号:G1120-100)购自北京索莱宝科技有限公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒、免疫组化试剂盒购自上海嵘崴达实业有限公司(货号:4890-025-K、11719386001);二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒、免疫荧光试剂盒、DMEM/F12培养基、兔抗鼠离子钙结合衔接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)购自北京百奥莱博科技有限公司(货号:ALH371-QIP、KFS019、SNM544-UEO、K18238-XID);兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗抗体均购自亚科因(武汉)生物技术有限公司(货号:A01021、A21020);兔抗鼠Rab5购自上海恒斐生物科技有限公司(货号:Rab5 Antibody);兔抗鼠Caspase-1购自武汉博欧特生物科技有限公司(货号:orb621674);NLRP3购自上海碧云天生物技术有限公司(货号:AF2155);蛋白提取试剂盒购自武汉纯度生物科技有限公司(货号:CD-13559-ML);新型隐球菌购自北京北纳创联生物技术研究院(编号:BNCC225501);蛋白凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司;荧光显微镜购自奥林巴斯 ......