张 博,周学才,朱冬梅,万 翔

    心肌损伤(myocardial injury,MI)普遍认可的定义为超声心动图和心电图出现异常或者心肌肌钙蛋白过高[1]。高血脂、高血压可以导致心肌缺血引发心肌梗死,通过介入手术或者药物溶栓可以实现缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R),但此时可以引发心肌损伤[2],其对病人生命健康有巨大威胁,且是病人死亡的独立因子[3]。探寻可以保护心肌细胞的药物具有重大意义。线粒体中谷氨酰胺代谢通路可以合成柠檬酸盐,其可以通过螯合血液内钙离子实现抗凝血的作用,同时可以抑制炎性因子[4],降低肾I/R损伤指标水平,明显提高肾I/R及炎性细胞因子从而影响的细胞活力[5]。5′-单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(5′-AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种代谢的中心调控因子,在细胞自噬与细胞极化过程中发挥重要调控作用,三磷酸腺苷(ATP)产生减少时,AMPK被磷酸化而激活[6],激活AMPK信号通路可以降低线粒体超氧化物的含量,调节心肌收缩能力,降低I/R引起的心肌梗死[7],肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)不仅是丝氨酸/苏氨酸激酶,也是代谢调控因子,具有调控炎症的作用[8]。激活LKB1/AMPK信号通路恢复肠道自噬,可改善肠道I/R损伤[9]。因此,本研究观察不同浓度柠檬酸盐对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导的人心肌细胞损伤及LKB1/AMPK信号通路的影响,探究保护心肌细胞的分子机制,为防止心肌细胞损伤提供理论基础。

    1 材料与方法

    1.1 细胞 人心肌细胞(HCM),货号:CP-H076,购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

    1.2 主要试剂及仪器 青霉素钠(Penicillin G Sodium)、AMPK抑制剂(Doxorubicin HCI,货号:S416001、S1208)购于上海蓝木化工有限公司;链霉素(货号:A103-01)购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司;DMEM basic(1X)高糖培养液(货号:C11995500BT)购于广州赛国生物科技有限公司;RPMI 1640 培养基(货号:12633012)购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;胰蛋白酶-乙二胺四乙酸二钠(EDTA)消化液、总RNA提取试剂盒、通用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒(M-MLV,货号:T1300、R1200、RP1100)购于北京索莱宝科技有限公司;Korser柠檬酸盐(货号:GR1962)购于上海广锐生物科技有限公司;细胞增殖毒性检测(CCK-8)试剂盒(货号:GK10001)购于上海宏叶生物科技有限公司;膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(货号:C1062S)购于上海碧云天生物技术有限公司;LKB1、AMPK、磷酸化LKB1(p-LKB1)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、Bcl-2、Bax、羊抗兔IgG、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号:ab138386、ab32047、ab63473、ab92701、ab321124、ab32503、ab150077、ab8245)购于美国Abcam公司 ......