别自东,郭 影

    心肌缺血后在恢复血流灌注过程中出现的心肌损伤进一步加重为心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)[1]。MI/RI在心血管系统疾病的治疗过程中较常出现,给病人的手术治疗带来了极大的困扰[2]。因此,减轻MI/RI对预后具有重要的临床意义。研究表明,非编码RNA在MI/RI的发生过程中发挥重要作用[3-4]。缺氧/复氧(H/R)可导致miR-30a在心肌细胞中的表达明显减少,上调miR-30a的表达可明显减少H/R诱导的心肌细胞存活力下降和凋亡[5]。另一种非编码RNA——环状RNA(circRNA)同样在各种心肌疾病中发挥关键作用[6]。circRNA的功能与微小RNA(miRNA)密切相关[7]。在线工具分析显示,circRNA-6874含有miR-30a的结合位点,且基质相互作用分子2(STIM2)是miR-30a的一个重要下游靶基因[8]。STIM2参与了多种心血管疾病的发生发展[9]。本研究探讨circRNA-6874是否通过调控miR-30a/STIM2在H/R中发挥作用。

    1 材料与方法

    1.1 主要试剂及仪器 人心肌细胞和专用心肌细胞培养基购自ScienCell研究实验室;胎牛血清、双抗、Lipofectamine 2000和SYBR Green PCR Master Mix购自美国赛默飞公司;Magna RIP试剂盒购自美国Merck公司;siRNAs和miRNAs购自广州锐博公司;荧光探针DCFH-DA、细胞计数试剂盒(CCK-8)、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)试剂和化学发光底物(ECL)购自上海碧云天公司;STIM2抗体和二抗购自美国Abcam公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂购自南京建成生物工程研究所;双荧光素酶报告载体和Dual Glo Luciferase Assay System购自美国Promega公司;细胞培养箱购自日本三洋公司;定量PCR仪购自美国ABI公司;荧光酶标仪购自美国赛默飞公司等。

    1.2 心肌细胞H/R模型的构建 人心肌细胞用含5%胎牛血清、双抗和1%心肌细胞生长添加物的专用心肌细胞培养基进行培养。无糖培养基先用含95%N2和5%CO2的气体预处理30 min后加入心肌细胞中。将上述细胞置于37 ℃及含94%N2、1%O2、5%CO2的培养箱中缺氧培养8 h,然后更换正常培养基于37 ℃、含5%CO2的培养箱中复氧培养24 h ......