娄 萍,赵 欣,赵 颖,张 丹

    川崎病是一种皮肤黏膜淋巴结综合征,并发症表现为冠状动脉和心肌损伤,主要病理改变为全身非特异性血管炎,肌原纤维断裂及溶解,心肌细胞水肿、变性和坏死及炎性浸润等[1]。相关研究显示,川崎病可能与炎症及免疫调节失衡有关,由于免疫细胞的过度激活,使产生多种细胞因子介导的促炎与抗炎反应调节失衡,增强心脏冠状动脉损伤[2]。关于川崎病的临床研究越来越多,但川崎病诱发心肌损伤的机制尚未明确。他克莫司是一种新型免疫抑制剂,通过与细胞质内免疫亲和蛋白(macrophilin)结合抑制钙磷酸酶的活性,并调控T细胞活化,抑制肥大细胞释放细胞因子,可治疗炎症性皮肤疾病,目前他克莫司在临床中广泛用于器官移植和自身免疫系统疾病的治疗[3]。酪氨酸激酶(JAKs)/信号转导因子和转录激活因子(STATs)信号通路是细胞因子信号转导的重要途径,广泛分布于多种组织细胞,发挥特异的生物学作用,在参与机体免疫及肿瘤发展等过程中发挥着关键的作用[4]。有研究表明,JAKs/STATs信号通路与心脏等疾病的发生发展关系密切,介导了心肌细胞生长、存活,改善心血管疾病[5]。关于他克莫司治疗川崎病的研究报道较少。本研究观察他克莫司通过激活JAKs/STATs信号通路对川崎病小鼠血管内皮功能及心肌细胞凋亡的影响,可为临床治疗川崎病提供依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 选取健康级小鼠40只,雌雄各半,4～6个月龄,体质量150～240 g,购自基尔顿生物科技(上海),严格按照《实验动物管理条例》进行实验,动物许可证号:SYXK(上):2019-0075,温度15～18 ℃,湿度约为70%,每日12 h光照,喂养条件为自由摄取标准饲料,饮用干净自来水。

    1.2 实验试剂与仪器 他克莫司(上海第一生化药业有限公司),阿司匹林(广州天心制药厂),伊红液(上海麦克林公司),白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(上海酶联生物科技有限公司),无水乙醇(桂林中辉科技发展有限公司),干酪乳酸杆菌菌种(重庆天圣制药有限公司),心肌肌钙蛋白I试剂盒、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)试剂盒(南京建成生物工程研究所),FEITecnai G12型透射电镜(美国强生公司),切片机(上海医用仪器厂),多普勒超声仪(日本Nikon公司),免疫印迹化学放光底物(北京化学试剂公司)。

    1.3 动物模型建立 将干酪乳酸杆菌菌种(LCWE)接种于肉汤培养基中,在37 ℃厌氧环境下培养2 d,将培养基以3 000×g(重力加速度),离心30 min后弃上清,沉淀加入50 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)过夜并裂解,以3 000×g离心裂解液30 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后加RNA酶200 μg/mL混匀,37 ℃孵育2 h,离心弃上清后重复3次,再加入DNA酶200 μg/mL混匀,7 ℃孵育4 h,离心弃上清后重复3次,最后沉淀中加入胰蛋白酶200 μg/mL,37 ℃孵育4 h,离心弃上清后重复3次,以PBS将沉淀重悬,超声破碎仪冰上破碎2 h后5 ℃,8 000×g离心1 h,上清即为LCWE ......