卢 菁,王 非,张京兰

    缺血性脑卒中早期起病隐匿,发病时病情进展迅速,多数病人遗留偏瘫、认知障碍等,影响病人身心健康[1-2]。神经炎症认为是缺血性脑卒中发生及病情进展过程中的关键病理因素,调控过度活跃的神经炎症是改善缺血性脑卒中神经损伤的有效手段[3-4]。有研究表明,针灸可降低促炎细胞因子表达,抑制炎症细胞激活和浸润,减轻脑缺血/再灌注后的炎症,促使受损神经系统修复[5]。针刺脑卒中大鼠阳陵泉+配穴、关元、照海+申脉穴位,均可抑制炎症及凋亡信号激活,减少神经元凋亡数量[6]。针灸在缺血性脑卒中的临床治疗中亦具有明显疗效[7],但其分子机制尚未明确。有研究显示,缺血性脑卒中病人血清miRNA-221-3p水平降低[8],上调miRNA-221-3p可抑制氧化应激和神经元凋亡,减轻帕金森病小鼠神经元损伤[9]。C-C趋化因子受体5(C-C chemokine receptor 5,CCR5)是一种关键的神经炎症调控因子,其表达上调导致并维持持续的神经炎症,促使各种炎症相关神经系统疾病进展。通过TargetScanHuman 7.2数据库可见miR-221-3p与CCR5之间有结合位点,因此miR-221-3p/CCR5可作为缺血性脑卒中的潜在治疗靶点[10]。本研究通过构建缺血性脑卒中大鼠模型,观察针灸调节miR-221-3p/CCR5轴对缺血性脑卒中大鼠神经炎症的影响。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物 SD雄性大鼠,约6周龄,购自厦门万泰沧海生物技术有限公司[许可证号:SCXK(闽)2018-0002],无特定病原体(SPF)级,体质量为(195±15)g,均喂养在本院动物房的饲养笼中,动物房条件:12 h/12 h(明/暗)交替、温度(24.5±1.5)℃、湿度(55±5)%、噪声≤80 dB,大鼠适应饲养1周后用于实验,并遵照3R原则给予人道关怀。

    1.2 实验试剂及仪器 miR-221-3p antagomir、miR-221-3p antagomir阴性对照、野生型CCR5 3′-UTR报告质粒、miR-221-3p mimic、miR-221-3p mimic阴性对照、突变型CCR5 3′-UTR报告质粒、miR-221-3p及U6、CCR5、GAPDH引物均购自上海吉玛制药技术有限公司;三苯基氯化四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC,货号T8170)、总RNA提取试剂盒(货号R1200)、LipofectamineTM2000(货号11668)、一步法实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒(货号T2210)、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号D0010)购自北京索莱宝科技有限公司;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号ab245880)、大鼠白细胞介素(interleukin,IL)-10酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(货号ab214566)、大鼠IL-17 ELISA试剂盒(货号ab214028)、大鼠IL-18 ELISA试剂盒(货号ab213909)均购自美国Abcam公司;大鼠海马神经元细胞(货号CP-R107)、大鼠海马神经元细胞完全培养基(货号CM-R107)购自武汉普诺赛生命科技有限公司 ......