贾菲 朱艺欣 王艺臻

    摘要?目的：探討单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)和血红素加氧酶1(HO-1)在氯吡格雷(INN)抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激的血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达中的作用及机制。方法：①内皮细胞(ECs)用INN预处理24 h或N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预处理2 h，并用2，7-二氯荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)处理15 min，然后再用TNF-α处理20 min，测定活性氧(ROS)水平。②将ECs与INN孵育指定的时间点，蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HO-1蛋白、mRNA表达，测量HO-1活性。 将转染shHO-1的ECs与INN孵育24 h，再用TNF-α刺激6 h。在有或没有INN的情况下，将ECs与TNF-β孵育8 h，进行黏附测定。③将ECs与INN孵育不同的时间，对总蛋白进行磷酸化-AMPK(p-AMPK)和AMPK表达Western Blotting分析。 ECs用STO-609和化合物C(一种AMPK抑制剂)处理1 h，与INN一起孵育16 h。检测HO-1蛋白、mRNA表达，测量HO-1活性。 ECs用STO-609和化合物C处理1 h，然后与INN一起孵育24 h，检测谷胱甘肽(GSH)含量。④ECs用化合物C处理1 h，然后与INN孵育指定的时间，检测核因子-E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达。用shLuc或shNrf2转染ECs，用10 μmol/L INN处理16 h，检测HO-1蛋白、mRNA表达。⑤用TNF-α处理ECs，使用或不使用二甲基亚砜(DMSO)(空白载体)，INN，或INN+化合物C进行VCAM-1、p-AMPK和AMPK表达测量。在有或没有INN的情况下，将用shLuc或shNrf2转染的EC与TNF-α孵育8 h，检测VCAM-1表达。结果：INN减少了TNF-α诱导的ROS产生，并在时间上提示HO-1的表达和活性。 INN增加了细胞GSH水平。shHO-1阻断了INN对TNF-α诱导的HL-60细胞黏附的抑制作用。钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)/AMPK通路和Nrf2转录因子与INN诱导HO-1有关。另外，TNF-α明显增加了VCAM-1蛋白和mRNA的表达。INN处理显著抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。化合物C和shNrf2消除了TNF-α诱导的VCAM-1表达和HL-60细胞黏附。结论：氯吡格雷通过CaMKKβ/AMPK/Nrf2途径抑制TNF-α诱导的VCAM-1表达进而保护内皮细胞 ......