周奕婷，徐鑫悦，宋吉亮，李玉天，葛彬彬，王森森，房春燕，王学健(潍坊医学院药学院，山东潍坊 261053)

    氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)是半静息态肝癌干细胞的生物标志物[1]，增强APN 表达能促进肝癌干细胞存活。普通肝癌细胞单用化疗药氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)处理，APN上调，随之产生耐药性，合用APN 抑制剂乌苯美司(ubenimex)能明显增强5-FU、顺铂、阿霉素的细胞毒作用，减少肝癌肿瘤干细胞球形成[2-3]，提示靶向抑制APN 对于肝癌耐药可能具有良好的治疗效果。另外，APN 在肿瘤转移方面也发挥着重要作用[4]，因此该蛋白是一个很好的抗肿瘤治疗靶点[5]。

    目前已有多个实验室从事小分子氨肽酶N 抑制剂的合成[6-8]，因此检测目标化合物对氨肽酶N 的抑酶活性是必不可少的步骤。而原有的氨肽酶N 抑制剂抑酶活性检测试剂盒的酶源是从猪肾小体中提取的氨肽酶，已有文献表明，使用该试剂盒测定化合物抑酶活性不能准确反映对人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。同时该试剂盒价格昂贵(Sigma，L6007)，使用成本较高。因此本课题组开发了一种全新的方法，以人源的氨肽酶N 作为酶源，用于测定化合物的抑酶活性。我们从多种肿瘤细胞匀浆筛选到人白血病K562 细胞匀浆对APN 底物的催化能力最弱，使用该细胞以慢病毒过表达APN，并筛选到单克隆细胞株(K562-APN)，以该细胞匀浆作为酶源用于化合物抑酶活性评价[10]。本文主要对该试剂盒的精密度、准确度、稳定性等进行检测，评价该试剂盒能否用于氨肽酶N 抑制剂的抑酶活性测定。

    1 仪器与试药

    多功能读板机SpectraMax M5(Molecular Devices)，超声细胞破碎仪(南京宁凯仪器有限公司)，DNP-9082 电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司) ......