王真，吴方晖，阴忆烽，张毅，刘艳丽，宋云扬(国民核生化灾害防护国家重点实验室，北京 102205)

    瘙痒是一种可以引起抓挠反应的主观感觉，大多数的皮肤病以及系统性疾病都伴有瘙痒症状，长期的慢性瘙痒严重影响人们的生活质量。目前，由于瘙痒的发生发展机制尚不完全清楚，也因此缺乏较为有效完善的治疗方法。随着组胺依赖性和非组胺依赖性痒觉信号通路的发现，表明多种信号通路参与了痒觉信号的传导[1]。常见的瘙痒介质有生物胺类、神经肽类、类花生酸类、蛋白酶类及细胞因子类等多种，我们研究的黧豆蛋白酶属于蛋白酶类致痒介质，它是通过非组胺依赖性的痒觉信号通路传导瘙痒的。

    黧豆(Cowhage)是豆科黧豆属植物，多生在热带、亚热带地区，黧豆豆荚毛刺可以导致瘙痒。黧豆毛刺在刺入灵长类或啮齿类动物皮肤不久后可以产生持续几分钟的痒感[2]。早期的生化研究表明，黧豆毛刺中含有一种可以引发瘙痒的蛋白酶，称之为mucunain[3]。研究人员发现，mucunain 是通过一群对辣椒素敏感的传入神经纤维引发瘙痒的，它可以激活所有的机械热敏感的C 纤维，这与介导组胺诱发瘙痒的机械刺激不敏感的C 纤维不同，mucunain 诱导的瘙痒不能被抗组胺药所阻断[4-5]。Reddy 等[6]从黧豆豆荚毛刺中分离出天然黧豆蛋白酶并进行了重组表达，鉴定了mucunain 是一种半胱氨酸蛋白酶，并发现mucunain 是蛋白酶激活受体2 和4(proteinase activated receptor 2/4，PAR2/4)的配体，而且对PAR4 的活性大于对PAR2 的活性。在之后的研究中，人们发现与组胺引发的瘙痒相比，mucunain诱导的瘙痒感觉更为强烈，其瘙痒反应与慢性瘙痒更为类似，因此，mucunain 致痒可作为研究特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)等慢性瘙痒疾病的理想模型[7]。

    在止痒药物研究方面，抗组胺药物并不能有效解决临床瘙痒问题，而mucunain 作为一种非组胺机制的致痒物，常作为与组胺进行瘙痒方面比较性研究的典型致痒剂。到目前为止，仅有一篇文献报道了mucunain 的重组表达[6]。鉴于从黧豆毛刺中大量获取mucunain 比较困难，本研究主要开展黧豆蛋白酶的基因克隆表达与纯化，采用FLIPR 检测技术对重组黧豆蛋白酶的生物活性进行研究，以期可以高效地获得大量黧豆蛋白酶，为相关止痒剂的研究提供模型物质。

    1 材料

    1.1 试药

    pET-28a(+)-Sumo 载体(美国Novagen 公司)；DH5α感受态细胞、Rosetta(DE3)感受态细胞(北京天根生化科技有限公司) ......