香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建(2)
2.2植物重组表达载体的构建和鉴定
将pGEM-T载体进行Sac1/Xba1双酶切后，回收1.1kb处小片段，克隆到经Sac1/Xba1双酶切的双元载体上，因为酶切方向，35S启动子直接调控CHS基因序列的有义链，转录合成反义RNA序列。得到的阳性重组克隆经过PCR和酶切鉴定后确定为CHS基因反义表达载体。
讨论
香石竹是世界四大鲜切花之一，在花卉市场上占有重要的地位。花色是观赏植物最重要的指标之一，观赏植物产业一直不断开发新产品,以适应市场的需要。这些改良后的新品种应有更高的观赏价值和商品价值。改良的性状包括花的形态和花的颜色等。在花色改良的研究中,蓝色花一直是研究的重点。在众多观赏植物中,蓝色花偏少,用作观赏的切花香石竹、郁金香、月季、玫瑰等都缺乏蓝色花系[6]。到目前为止,大多数蓝色花的新品种都是采用传统育种法而获得的,此法有很多局限性。蓝花植物的花色素主要是翠雀素。翠雀素是通过B环3′和5′位置的羟化形成的,但多数缺乏蓝颜色的花都无在B环3′和5′羟化的花色素苷。有人对670种玫瑰栽培品种进行分析,结果没有见到任何在B环5′位置羟化的花色素苷的存在，因此用传统的育种法来培育缺乏前体的蓝花是不可能的[7]。
, 百拇医药
导入植物内某内源基因的正义或反义基因以抑制该内源基因的活性，是目前采用基因工程改变植物花色的主要方法之一。1990年,美国和荷兰的科学家发现,当植物体内导入的结构基因不止一个拷贝时,转基因植物的内源基因常被抑制[8]。将克隆的花色素苷生物合成结构基因导入植物细胞内,可以导致同源的内源结构基因表达改变，Jorgensen作了详细的评述[9]。Nopoli[10]等和Van der Krol等分别将CHS或DFR导入矮牵牛植株导致同源的内源CHS和DFR基因表达受到抑制。Van der Krol等将结构基因的反义CHS基因导入矮牵牛，导致矮牵牛内源的CHS结构基因表达受到抑制，引起花色变异[11]。在反义CHS基因启动子中加入28bp的花药盒(anther box)，导入矮牵牛后，反义CHS基因表达量显著增加，强烈抑制内源的CHS基因表达，导致类黄酮生物合成受到强烈的抑制，最终引起矮牵牛的雄性不育[12]。
本研究通过克隆香石竹中的花色关键酶CHS的基因序列，构建了其反义表达载体，旨在应用反义技术，对香石竹花色机理进行探研，以期获得花色变异的品系。目前，该载体转化香石竹的工作以及CHS基因反义序列原核表达载体的构建工作正在进行。
, 百拇医药
参考文献
[1] StevensonTW.PlantGeneticEngineering.London:CRCPress,1990.127～1482
[2] MeerMI.ControlofPlantGeneExpression.London:CRCPress,1993.1～18
[3] 葛欣,赵宇,张建军等 花卉的品质改良与反义RNA技术北方园艺总第31期，35
[4]KoesRE,SpeltCE,vanderElzenPJM.Cloningandmolecularcharacterizationofthechalconesynthasemultigenefamilyofpetuniahybrida.Gene,1989.81:245～257
, 百拇医药 [5] 邵利、李毅、陈章良等 查尔酮合酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的高效表达 生物工程学报 11(2):145～149 1995
[6] 黄胤怡沈明山李鹏等 蓝色花的基因工程 植物生理学通讯38(2):203～206 2004
[7] 许智宏,刘春明.植物发育的分子机理.北京:科学出版社,1998.115～116
[8] 黄胤怡沈明山李鹏等 蓝色花的基因工程 植物生理学通讯38(2):203～206 2004
作者单位：678000 云南省保山市隆阳区保山中医药高等专科学校, 百拇医药(蔡鹏 郑月)
将pGEM-T载体进行Sac1/Xba1双酶切后，回收1.1kb处小片段，克隆到经Sac1/Xba1双酶切的双元载体上，因为酶切方向，35S启动子直接调控CHS基因序列的有义链，转录合成反义RNA序列。得到的阳性重组克隆经过PCR和酶切鉴定后确定为CHS基因反义表达载体。
讨论
香石竹是世界四大鲜切花之一，在花卉市场上占有重要的地位。花色是观赏植物最重要的指标之一，观赏植物产业一直不断开发新产品,以适应市场的需要。这些改良后的新品种应有更高的观赏价值和商品价值。改良的性状包括花的形态和花的颜色等。在花色改良的研究中,蓝色花一直是研究的重点。在众多观赏植物中,蓝色花偏少,用作观赏的切花香石竹、郁金香、月季、玫瑰等都缺乏蓝色花系[6]。到目前为止,大多数蓝色花的新品种都是采用传统育种法而获得的,此法有很多局限性。蓝花植物的花色素主要是翠雀素。翠雀素是通过B环3′和5′位置的羟化形成的,但多数缺乏蓝颜色的花都无在B环3′和5′羟化的花色素苷。有人对670种玫瑰栽培品种进行分析,结果没有见到任何在B环5′位置羟化的花色素苷的存在，因此用传统的育种法来培育缺乏前体的蓝花是不可能的[7]。
, 百拇医药
导入植物内某内源基因的正义或反义基因以抑制该内源基因的活性，是目前采用基因工程改变植物花色的主要方法之一。1990年,美国和荷兰的科学家发现,当植物体内导入的结构基因不止一个拷贝时,转基因植物的内源基因常被抑制[8]。将克隆的花色素苷生物合成结构基因导入植物细胞内,可以导致同源的内源结构基因表达改变，Jorgensen作了详细的评述[9]。Nopoli[10]等和Van der Krol等分别将CHS或DFR导入矮牵牛植株导致同源的内源CHS和DFR基因表达受到抑制。Van der Krol等将结构基因的反义CHS基因导入矮牵牛，导致矮牵牛内源的CHS结构基因表达受到抑制，引起花色变异[11]。在反义CHS基因启动子中加入28bp的花药盒(anther box)，导入矮牵牛后，反义CHS基因表达量显著增加，强烈抑制内源的CHS基因表达，导致类黄酮生物合成受到强烈的抑制，最终引起矮牵牛的雄性不育[12]。
本研究通过克隆香石竹中的花色关键酶CHS的基因序列，构建了其反义表达载体，旨在应用反义技术，对香石竹花色机理进行探研，以期获得花色变异的品系。目前，该载体转化香石竹的工作以及CHS基因反义序列原核表达载体的构建工作正在进行。
, 百拇医药
参考文献
[1] StevensonTW.PlantGeneticEngineering.London:CRCPress,1990.127～1482
[2] MeerMI.ControlofPlantGeneExpression.London:CRCPress,1993.1～18
[3] 葛欣,赵宇,张建军等 花卉的品质改良与反义RNA技术北方园艺总第31期，35
[4]KoesRE,SpeltCE,vanderElzenPJM.Cloningandmolecularcharacterizationofthechalconesynthasemultigenefamilyofpetuniahybrida.Gene,1989.81:245～257
, 百拇医药 [5] 邵利、李毅、陈章良等 查尔酮合酶基因的克隆、全序列分析及在大肠杆菌中的高效表达 生物工程学报 11(2):145～149 1995
[6] 黄胤怡沈明山李鹏等 蓝色花的基因工程 植物生理学通讯38(2):203～206 2004
[7] 许智宏,刘春明.植物发育的分子机理.北京:科学出版社,1998.115～116
[8] 黄胤怡沈明山李鹏等 蓝色花的基因工程 植物生理学通讯38(2):203～206 2004
作者单位：678000 云南省保山市隆阳区保山中医药高等专科学校, 百拇医药(蔡鹏 郑月)