香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建(1)
【中图分类号】R943【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2011)06-0002-02
【摘要】根据已发表的查尔酮合酶(CHS)基因的序列，设计一对引物，以香石竹品种 Master 的总cDNA为模板,扩增出香石竹查尔酮合酶基因全阅读框架序列，以Pgem-T为中间载体，序列检测的结果显示同Henkel,J.等在NCBI的基因库中发表的从香石竹品种“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全开放阅读框序列一致。将序列反义克隆到双元载体PBI-121上，并导入农杆菌中 ，经PCR及酶切分析鉴定，结果表明该片段的反义序列已克隆于载体中。
【关键词】查尔酮合酶 植物反义表达载体 基因克隆
花色的形成与植物体内一类次级代谢产物类黄酮有关。在花色形成中起最主要作用的是花色素。花色素在花瓣中含量的增高或降低都可能改变花的颜色[1]。查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花色素合成中的一个关键酶,它催化丙二酰辅酶A的3个乙酸基和对羟基苯丙烯酰辅酶A的一个乙酸基的缩合,产生柚配基查尔酮[2]。
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反义RNA(Antisense RNA )技术是通过人工导入反义RNA,调控细胞内某些基因的表达,从而定向控制某些生物性状。该项技术在基因功能研究、恶性生长控制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日渐显著。反义RNA技术可以专一性地调节某一基因的活动,进一步了解这个基因的作用,这对研究未知基因的功能和表达情况提供了思路和途径,也为人类控制基因活动提供了方法。由于反义RNA主要作用于转录水平,所以它可以避免二倍体生物同源基因互补而产生的困难。此外,反义RNA对基因的调节不会改变目的基因的结构,在应用上更为安全。为此,近年来利用反义RNA技术在花卉的品质改良上取得了很有价值的成果[3]。
在植物中，CHS组成了一个多基因家族，具有8—10个成员，位于两个不同染色体上[4]，并且其正常表达主要集中于花组织中(花冠和花药)[5]。在本研究中，我们从特定发育阶段的香石竹花瓣中通过rt-PCR方法克隆到CHS基因的cDNA序列，并以此为模板构建了其反义基因的植物表达载体。
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1材料和方法
1.1 材料：香石竹品种 由云南省农科院花卉中心提供，大肠杆菌DH5a，农杆菌LBA4404，双元表达载体PBI-121为云南省生物技术重点实验室保存，克隆载体pGEM-T试剂盒，cDNA合成试剂盒购自Promega公司, 其余分子生物学试剂均购自华美生物工程公司.
2 方法
1.2.1 植物组织总RNA的提取：香石竹的花蕾长到3-5厘米即将开放时将其采下，置于-700冻.藏。临用时，取1-2个这样的花蕾用液氮研磨成粉末，根据购自Promega公司的Trizol总RNA提取试剂盒内说明书的指示步骤：加入1 ml Trizol剧烈振荡15 s，室温放置5 min。后加入200 l氯仿，剧烈振荡15 s，室温下放置3 min后于4℃，12,000×g，离心15 min。然后取上层水相，加入500 l异丙醇，室温下放置10 min。再于4℃下，12,000×g，离心10 min。最后弃上清，沉淀用1 ml 70%的乙醇洗两次，在超净台上吹干，溶于适量DEPC处理过的灭菌水中，-20℃保存备用。
, http://www.100md.com
1.2.2cDNA第一链的合成：cDNA第一链的合成按照Promega公司cDNA合成试剂盒内的说明书进行。以香石竹的总RNA为模板，oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下,合成cDNA第一链，于-20℃保存备用。
1.2.3扩增CHS基因序列：根据 NCBI上发表的香石竹CHS基因的cDNA序列，设计一对引物，由上海博亚生物工程公司合成，引物序列为：ACHS5’- AAGAGCTCATGGCATCAATTGAGGA-3’ ACHSAt5’- GGTCTAGATCAACAATTCAATGGAAC-3’以合成的cDNA为模扳进行PCR扩增，反应的条件为94℃变性40秒，50℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟，共35个循环。
1.2.4PCR扩增产物的克隆：对PCR扩增产物进行回收纯化,根据克隆载体pGEM-T试剂盒操作说明，在T4连接酶的作用下，将其连接于克隆载体pGEM-T上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，其后涂布于x-gal/IPTG培养基上过夜培养。
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1.2.5克隆子的测序鉴定：挑取白色菌落进行培养，送由上海博亚生物工程公司进行测序。 将测序后含有CHS基因的菌体抽提质粒保存。
1.2.6CHS基因植物反义表达载体的构建：PCR引物设计时在两端加上了Sac1和Xba1酶切位点，因此，将含有CHS基因的质粒抽提纯化好后进行Sac1和Xba1双酶切,将小片段回收后克隆到经过Sac1和Xba1双酶切的双元表达载体PBI121的大片段上,得到CHS基因植物反义表达载体。
2 结果
2.1 在植物正常发育过程中,只有CHSA和CHSJ被表达,并且这种表达限于花组织中(花冠和花药),其中由CHSA转录的mRNA占总CHSmRNA的90%。以逆转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到1.1kb左右的片段，将此片段回收纯化后，克隆于pGEM-T载体上，挑取8个白色菌落经测序后，得到克隆序列有1173bp，与Henkel,J.等在NCBI的基因库中发表的从香石竹品种“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全开放阅读框序列一致。其序列如下(划线部分为两端引物)：
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5’-GGCATCAATTGAGGAGATTCGTCAGGCTCCAAGGGCCGATGGTCCTGCTACTATTTTGGCTATCGGTACTGCTACTCCGCCCAATGCTATCTATCAGGCAGATTATCCCGATTATTATTTTCGGGTTACTAAGAGTGAACATATGACTGAATTGAAGGAGAAATTTCGACGCATGTGCGATAAGTCGATGATCAAAAAGCGATACATGTACCTAACCGAGGAAATCCTCAAGGAGAACCCGAACTTGTGTGAGTACATGGGTTCATCTCTCGACACACGACAAGACATGGTCGTTTCGGAGGTCCCTAGGCTAGGCAAAGAAGCCGCGGTGAAGGCCATTAAGGAGTGGGGCCAACCTAAGTCCAAAATAACTCACGTTATCATGTGCACCACCTCCGGTGTCGACATGCCCGGGGCTGACTACCAGCTCACTAAGCTCCTTGGGTTGCGTCCCTCTGTCCGTCGCTTCATGCTCTACCAACAGGGTTGCTTCGCCGGGGGAACGGTTCTAAGGCTTGCTAAGGACTTGGCTGAGAACAACAAGGATGCGCGTGTCCTTGTTGTCTGTTCTGAAATCACTGCTATTTGTTTTAGGGGCCCCACCGAGGCTGCTTTGGACTCCATGGTGGGCCAAGCCCTCTTTGGGGATGGTGCTGGAGCCTTGATTGTTGGGTCGGACCCCGACTTGTCGATTGAGAGACCCCTTTTTCAAATGGCTTGGGCCGGTCAAACCCTACTCCCTGACTCCGACGGGGCTATCGACGGACACTTGCGTGAGGTGGGTCTCACTTTTCACCTGCTCAAGGACGTGCCGGGGATTATTTCGAAGAATATTACTAACGCCCTAGAGGATGCGTTCAGTCCTATCGGGGTAAGTGACTGGAACAATCTATTTTGGATCGCGCACCCTGGTGGGCCCGCAATCCTAGACCAAGTCGAGGCCAAATTGGGGCTAAAGGAAGAGAAGCTGGCAGCCACTAGGAATGTGTTGAGCGACTTTGGGAACATGTCGAGCGCGTGCGTGCTGTTCATTCTGGATGAAATGAGGAAGAAGTCGCTTAGAGACGGTGCGACCACAACAGGTGAAGGGCTCGATTGGGGTGTTCTGTTCGGGTTTGGGCCAAGTTTGACCGTCGAAACGGTCGTGCTCCACAGTGTTCCATTGAATTGTTG-3’, http://www.100md.com(蔡鹏 郑月)
【摘要】根据已发表的查尔酮合酶(CHS)基因的序列，设计一对引物，以香石竹品种 Master 的总cDNA为模板,扩增出香石竹查尔酮合酶基因全阅读框架序列，以Pgem-T为中间载体，序列检测的结果显示同Henkel,J.等在NCBI的基因库中发表的从香石竹品种“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全开放阅读框序列一致。将序列反义克隆到双元载体PBI-121上，并导入农杆菌中 ，经PCR及酶切分析鉴定，结果表明该片段的反义序列已克隆于载体中。
【关键词】查尔酮合酶 植物反义表达载体 基因克隆
花色的形成与植物体内一类次级代谢产物类黄酮有关。在花色形成中起最主要作用的是花色素。花色素在花瓣中含量的增高或降低都可能改变花的颜色[1]。查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花色素合成中的一个关键酶,它催化丙二酰辅酶A的3个乙酸基和对羟基苯丙烯酰辅酶A的一个乙酸基的缩合,产生柚配基查尔酮[2]。
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反义RNA(Antisense RNA )技术是通过人工导入反义RNA,调控细胞内某些基因的表达,从而定向控制某些生物性状。该项技术在基因功能研究、恶性生长控制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日渐显著。反义RNA技术可以专一性地调节某一基因的活动,进一步了解这个基因的作用,这对研究未知基因的功能和表达情况提供了思路和途径,也为人类控制基因活动提供了方法。由于反义RNA主要作用于转录水平,所以它可以避免二倍体生物同源基因互补而产生的困难。此外,反义RNA对基因的调节不会改变目的基因的结构,在应用上更为安全。为此,近年来利用反义RNA技术在花卉的品质改良上取得了很有价值的成果[3]。
在植物中，CHS组成了一个多基因家族，具有8—10个成员，位于两个不同染色体上[4]，并且其正常表达主要集中于花组织中(花冠和花药)[5]。在本研究中，我们从特定发育阶段的香石竹花瓣中通过rt-PCR方法克隆到CHS基因的cDNA序列，并以此为模板构建了其反义基因的植物表达载体。
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1材料和方法
1.1 材料：香石竹品种 由云南省农科院花卉中心提供，大肠杆菌DH5a，农杆菌LBA4404，双元表达载体PBI-121为云南省生物技术重点实验室保存，克隆载体pGEM-T试剂盒，cDNA合成试剂盒购自Promega公司, 其余分子生物学试剂均购自华美生物工程公司.
2 方法
1.2.1 植物组织总RNA的提取：香石竹的花蕾长到3-5厘米即将开放时将其采下，置于-700冻.藏。临用时，取1-2个这样的花蕾用液氮研磨成粉末，根据购自Promega公司的Trizol总RNA提取试剂盒内说明书的指示步骤：加入1 ml Trizol剧烈振荡15 s，室温放置5 min。后加入200 l氯仿，剧烈振荡15 s，室温下放置3 min后于4℃，12,000×g，离心15 min。然后取上层水相，加入500 l异丙醇，室温下放置10 min。再于4℃下，12,000×g，离心10 min。最后弃上清，沉淀用1 ml 70%的乙醇洗两次，在超净台上吹干，溶于适量DEPC处理过的灭菌水中，-20℃保存备用。
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1.2.2cDNA第一链的合成：cDNA第一链的合成按照Promega公司cDNA合成试剂盒内的说明书进行。以香石竹的总RNA为模板，oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下,合成cDNA第一链，于-20℃保存备用。
1.2.3扩增CHS基因序列：根据 NCBI上发表的香石竹CHS基因的cDNA序列，设计一对引物，由上海博亚生物工程公司合成，引物序列为：ACHS5’- AAGAGCTCATGGCATCAATTGAGGA-3’ ACHSAt5’- GGTCTAGATCAACAATTCAATGGAAC-3’以合成的cDNA为模扳进行PCR扩增，反应的条件为94℃变性40秒，50℃退火1分钟， 72℃延伸2分钟，共35个循环。
1.2.4PCR扩增产物的克隆：对PCR扩增产物进行回收纯化,根据克隆载体pGEM-T试剂盒操作说明，在T4连接酶的作用下，将其连接于克隆载体pGEM-T上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，其后涂布于x-gal/IPTG培养基上过夜培养。
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1.2.5克隆子的测序鉴定：挑取白色菌落进行培养，送由上海博亚生物工程公司进行测序。 将测序后含有CHS基因的菌体抽提质粒保存。
1.2.6CHS基因植物反义表达载体的构建：PCR引物设计时在两端加上了Sac1和Xba1酶切位点，因此，将含有CHS基因的质粒抽提纯化好后进行Sac1和Xba1双酶切,将小片段回收后克隆到经过Sac1和Xba1双酶切的双元表达载体PBI121的大片段上,得到CHS基因植物反义表达载体。
2 结果
2.1 在植物正常发育过程中,只有CHSA和CHSJ被表达,并且这种表达限于花组织中(花冠和花药),其中由CHSA转录的mRNA占总CHSmRNA的90%。以逆转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到1.1kb左右的片段，将此片段回收纯化后，克隆于pGEM-T载体上，挑取8个白色菌落经测序后，得到克隆序列有1173bp，与Henkel,J.等在NCBI的基因库中发表的从香石竹品种“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全开放阅读框序列一致。其序列如下(划线部分为两端引物)：
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