Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响探讨
【摘 要】目的:分析Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响与机制。方法:利用空白试剂、阴性病毒以及Fgl2siRNA慢病毒对H9C2心肌细胞进行感染。将其分为空白对照组、阴性对照组以及Fgl2siRNA组,然后经过48小时后,利用Wsetern印迹对各组细胞内的Fgl2蛋白表达进行检测;对酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达进行检测;利用流式细胞术对细胞的凋亡情况进行检测。结果:空白对照组与阴性对照组的Fgl2蛋白表达不具有统计学意义(P>0.05),而Fgl2siRNA组的Fgl2蛋白表达与空白对照组相比具有统计学意义(P<0.01);酶切caspase3的蛋白表达下降,Notch1以及Hesl的蛋白表达上升,都具有统计学意义(P<0.01);Fgl2组的H9C2细胞凋亡降低趋势较为明显,具有统计学意义(P<0.01)。结论:Fgl2基因对H9C2心肌细胞的凋亡具有明显抑制作用,而其机制与下调酶切caspase3蛋白表达以及激活Notch1信号通路有关。
【关键词】Fgl2基因;心肌细胞;凋亡影响;纤维蛋白原样
【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2018)06-03--01
经过相关的医学研究发现,心肌疾病中都会出现心肌细胞凋亡,而心肌细胞凋亡会引起各种慢性心力衰竭、心室重塑等病症。因此,抑制心肌细胞凋亡对心肌疾病具有一定的预防效果。对心肌细胞凋亡进行抑制可以改善心肌生存环境,减轻心脏重塑,有助于心肌疾病的后续治疗。而Fgl2基因是一种纤维蛋白原样,主要表达在T细胞、巨噬细胞以及内皮细胞中,它是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,主要功能为调节免疫与凝血。
1 研究材料与研究方法
1.1 研究材料
此次试验研究过程中主要使用的研究材料为H9C2心肌细胞株,是从中国科学院细胞库中选购的。研究过程中使用的主要研究试剂包括:(1)RPMI1640培养基与胎牛血清;(2)阴性病毒、Fgl2 siRNA慢病;(3)二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒以及电化学发光(ECL)试剂盒;(4)细胞凋亡试剂盒、酶切caspase3、Notch1以及Hesl抗体。而研究中使用的仪器主要有:CO2细胞培养箱、流式细胞仪、电泳凝胶图像分析系统以及聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。
1.2 研究方法
研究过程包括细胞培养、细胞转染以及效果检测、细胞凋亡检测、Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。(1)细胞培养。取出心肌细胞冻存管放入37℃水中解冻,并要轻轻晃动冻存管,加速解冻过程。解冻完成后,将心肌细胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中进行培养,培养条件为:37℃、5%CO2以及饱和湿度为95%的恒温培养箱。第二天更换培养液。按照实验需要传代,选取对数生长期的细胞进行研究。(2)细胞转染及效果检测。以1×105个/孔对生长至对数期的心肌细胞进行接种,使用的细胞培养板为6孔。细胞生长密度达到60%时,要及时更换培养基,对空白试剂组、阴性病毒组以及Fgl2 siRNA组对心肌细胞的感染程度进行检测。取48小时后的细胞,向内加入PMSF和RIPA裂解液,然后放在4℃冰上反应30分钟,使用每分钟12000转的离心15分钟,收集蛋白。用BCA试剂盒对蛋白进行定量。然后取出50微克蛋白样品使用12%十二烷基硫酸与聚丙烯酰胺凝胶电泳仪进行分离,电泳结束后使用PVDF转膜、5%脱脂奶粉进行封闭,加入一抗(1:400稀释的Fgl2和1:1000稀释的GAPDH),放置于4℃环境中孵育。第二天用TBST洗膜(3次,每次5分钟),然后加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记过的羊抗鼠IgG,在室温中孵育1小时,再次进行TBST洗膜,利用ECL化学发光剂显色,在室温避光环境中完成显影与定影。以GAPDH为参照,对Fgl2的蛋白表达水平进行对比分析。(3)細胞凋亡检测。主要利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测,然后对心肌细胞的凋亡率进行计算分析。(4)Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。取出经过转染培养的各组细胞,利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行检测,然后检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。
2 研究结果
使用SPSS21.0软件对研究资料进行差异比较,两组比较结果用t检验。此次研究中,空白对照组、阴性病毒对照组以及Fgl2 siRNA组的结果分别为:(1)Fgl2蛋白表达水平。空白对照组与阴性病毒组的蛋白表达为[(0.445±0.051)VS(0.442±0.050)],差异不具有统计学意义;而Fgl2 siRNA组的蛋白表达水平为(0.182±0.028),明显低于空白对照组与阴性病毒组,具有统计学意义。(2)心肌细胞凋亡情况。空白对照组与阴性病毒组的细胞凋亡分别为[(1.25±0.28)%]、[(1.24±0.29)%],而Fgl2 siRNA组的细胞凋亡为[(5.76±0.57)%],降低趋势明显。(3)酶切easpase3,Noteh1,Hesl蛋白表达情况。Fgl2 siRNA组的酶切easpase3蛋白明显下调表达,而Notchl,Hesl蛋白明显上升。
3 结论
一直以来心血管疾病都是威胁人类健康的重要疾病,而患者在发病过程中因心肌缺血缺氧导致心肌细胞凋亡、心室扩张、心脏重塑等症,最终导致患者心力衰竭。本次研究显示,沉默Fgl2表达可以明显降低H9C2细胞的凋亡。而caspase家族是细胞凋亡的重要通路,其中caspase3是多种凋亡刺激信号的最终汇集点,它的活性是细胞凋亡进行不可逆阶段的标志,根据研究发现下调easpase3表达能够降低心肌细胞的凋亡。所以,沉默Fgl2表达可以借助抑制酶切easpase3表达实现降低心肌细胞凋亡的目的。而Fgl2表达激活Notch1信号通路,可以限制心肌细胞的凋亡,为治疗心血管疾病提供理论基础。
参考文献
俞芽法,郑振中.Fgl2-shRNA基因沉默对糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形态变化[J].西安交通大学学报(医学版),2015,36(5):605-608.
杨东艳,李刚,张蕾,等.C3G基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响[J].解放军医学杂志,2015,40(8):603-609.
SOX6 and PDCD4 enhance cardiomyocyte apoptosis through LPS-induced miR-499 inhibition.Jia Z,Wang J,Shi Q,et al.Apoptosis .2016
Overexpression of Fibrinogen-Like Protein 2 Promotes Tolerance in a Fully Mismatched Murine Model of Heart Transplantation.Bartczak A,Chruscinski A,Mendicino M,et al.American Journal of Transplantation .2016
Association of Soluble Fibrinogen-like Protein 2with the Severity of Coronary Artery Disease.Cheng J,Chen Y,Xu B,et al.Journal of Internal Medicine .2016, http://www.100md.com(肖懿峰 袁逸铭)
【关键词】Fgl2基因;心肌细胞;凋亡影响;纤维蛋白原样
【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2018)06-03--01
经过相关的医学研究发现,心肌疾病中都会出现心肌细胞凋亡,而心肌细胞凋亡会引起各种慢性心力衰竭、心室重塑等病症。因此,抑制心肌细胞凋亡对心肌疾病具有一定的预防效果。对心肌细胞凋亡进行抑制可以改善心肌生存环境,减轻心脏重塑,有助于心肌疾病的后续治疗。而Fgl2基因是一种纤维蛋白原样,主要表达在T细胞、巨噬细胞以及内皮细胞中,它是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白,主要功能为调节免疫与凝血。
1 研究材料与研究方法
1.1 研究材料
此次试验研究过程中主要使用的研究材料为H9C2心肌细胞株,是从中国科学院细胞库中选购的。研究过程中使用的主要研究试剂包括:(1)RPMI1640培养基与胎牛血清;(2)阴性病毒、Fgl2 siRNA慢病;(3)二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒以及电化学发光(ECL)试剂盒;(4)细胞凋亡试剂盒、酶切caspase3、Notch1以及Hesl抗体。而研究中使用的仪器主要有:CO2细胞培养箱、流式细胞仪、电泳凝胶图像分析系统以及聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。
1.2 研究方法
研究过程包括细胞培养、细胞转染以及效果检测、细胞凋亡检测、Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。(1)细胞培养。取出心肌细胞冻存管放入37℃水中解冻,并要轻轻晃动冻存管,加速解冻过程。解冻完成后,将心肌细胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中进行培养,培养条件为:37℃、5%CO2以及饱和湿度为95%的恒温培养箱。第二天更换培养液。按照实验需要传代,选取对数生长期的细胞进行研究。(2)细胞转染及效果检测。以1×105个/孔对生长至对数期的心肌细胞进行接种,使用的细胞培养板为6孔。细胞生长密度达到60%时,要及时更换培养基,对空白试剂组、阴性病毒组以及Fgl2 siRNA组对心肌细胞的感染程度进行检测。取48小时后的细胞,向内加入PMSF和RIPA裂解液,然后放在4℃冰上反应30分钟,使用每分钟12000转的离心15分钟,收集蛋白。用BCA试剂盒对蛋白进行定量。然后取出50微克蛋白样品使用12%十二烷基硫酸与聚丙烯酰胺凝胶电泳仪进行分离,电泳结束后使用PVDF转膜、5%脱脂奶粉进行封闭,加入一抗(1:400稀释的Fgl2和1:1000稀释的GAPDH),放置于4℃环境中孵育。第二天用TBST洗膜(3次,每次5分钟),然后加入1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记过的羊抗鼠IgG,在室温中孵育1小时,再次进行TBST洗膜,利用ECL化学发光剂显色,在室温避光环境中完成显影与定影。以GAPDH为参照,对Fgl2的蛋白表达水平进行对比分析。(3)細胞凋亡检测。主要利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测,然后对心肌细胞的凋亡率进行计算分析。(4)Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。取出经过转染培养的各组细胞,利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行检测,然后检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。
2 研究结果
使用SPSS21.0软件对研究资料进行差异比较,两组比较结果用t检验。此次研究中,空白对照组、阴性病毒对照组以及Fgl2 siRNA组的结果分别为:(1)Fgl2蛋白表达水平。空白对照组与阴性病毒组的蛋白表达为[(0.445±0.051)VS(0.442±0.050)],差异不具有统计学意义;而Fgl2 siRNA组的蛋白表达水平为(0.182±0.028),明显低于空白对照组与阴性病毒组,具有统计学意义。(2)心肌细胞凋亡情况。空白对照组与阴性病毒组的细胞凋亡分别为[(1.25±0.28)%]、[(1.24±0.29)%],而Fgl2 siRNA组的细胞凋亡为[(5.76±0.57)%],降低趋势明显。(3)酶切easpase3,Noteh1,Hesl蛋白表达情况。Fgl2 siRNA组的酶切easpase3蛋白明显下调表达,而Notchl,Hesl蛋白明显上升。
3 结论
一直以来心血管疾病都是威胁人类健康的重要疾病,而患者在发病过程中因心肌缺血缺氧导致心肌细胞凋亡、心室扩张、心脏重塑等症,最终导致患者心力衰竭。本次研究显示,沉默Fgl2表达可以明显降低H9C2细胞的凋亡。而caspase家族是细胞凋亡的重要通路,其中caspase3是多种凋亡刺激信号的最终汇集点,它的活性是细胞凋亡进行不可逆阶段的标志,根据研究发现下调easpase3表达能够降低心肌细胞的凋亡。所以,沉默Fgl2表达可以借助抑制酶切easpase3表达实现降低心肌细胞凋亡的目的。而Fgl2表达激活Notch1信号通路,可以限制心肌细胞的凋亡,为治疗心血管疾病提供理论基础。
参考文献
俞芽法,郑振中.Fgl2-shRNA基因沉默对糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形态变化[J].西安交通大学学报(医学版),2015,36(5):605-608.
杨东艳,李刚,张蕾,等.C3G基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响[J].解放军医学杂志,2015,40(8):603-609.
SOX6 and PDCD4 enhance cardiomyocyte apoptosis through LPS-induced miR-499 inhibition.Jia Z,Wang J,Shi Q,et al.Apoptosis .2016
Overexpression of Fibrinogen-Like Protein 2 Promotes Tolerance in a Fully Mismatched Murine Model of Heart Transplantation.Bartczak A,Chruscinski A,Mendicino M,et al.American Journal of Transplantation .2016
Association of Soluble Fibrinogen-like Protein 2with the Severity of Coronary Artery Disease.Cheng J,Chen Y,Xu B,et al.Journal of Internal Medicine .2016, http://www.100md.com(肖懿峰 袁逸铭)