Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响探讨
【摘 要】目的：分析Fgl2基因对H9C2心肌细胞凋亡的影响与机制。方法：利用空白试剂、阴性病毒以及Fgl2siRNA慢病毒对H9C2心肌细胞进行感染。将其分为空白对照组、阴性对照组以及Fgl2siRNA组，然后经过48小时后，利用Wsetern印迹对各组细胞内的Fgl2蛋白表达进行检测；对酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达进行检测；利用流式细胞术对细胞的凋亡情况进行检测。结果：空白对照组与阴性对照组的Fgl2蛋白表达不具有统计学意义(P>0.05)，而Fgl2siRNA组的Fgl2蛋白表达与空白对照组相比具有统计学意义(P<0.01)；酶切caspase3的蛋白表达下降，Notch1以及Hesl的蛋白表达上升，都具有统计学意义(P<0.01)；Fgl2组的H9C2细胞凋亡降低趋势较为明显，具有统计学意义(P<0.01)。结论：Fgl2基因对H9C2心肌细胞的凋亡具有明显抑制作用，而其机制与下调酶切caspase3蛋白表达以及激活Notch1信号通路有关。
【关键词】Fgl2基因；心肌细胞；凋亡影响；纤维蛋白原样
【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2018)06-03--01
经过相关的医学研究发现，心肌疾病中都会出现心肌细胞凋亡，而心肌细胞凋亡会引起各种慢性心力衰竭、心室重塑等病症。因此，抑制心肌细胞凋亡对心肌疾病具有一定的预防效果。对心肌细胞凋亡进行抑制可以改善心肌生存环境，减轻心脏重塑，有助于心肌疾病的后续治疗。而Fgl2基因是一种纤维蛋白原样，主要表达在T细胞、巨噬细胞以及内皮细胞中，它是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要功能为调节免疫与凝血。
1 研究材料与研究方法
1.1 研究材料
此次试验研究过程中主要使用的研究材料为H9C2心肌细胞株，是从中国科学院细胞库中选购的。研究过程中使用的主要研究试剂包括：(1)RPMI1640培养基与胎牛血清；(2)阴性病毒、Fgl2 siRNA慢病；(3)二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒以及电化学发光(ECL)试剂盒；(4)细胞凋亡试剂盒、酶切caspase3、Notch1以及Hesl抗体。而研究中使用的仪器主要有：CO2细胞培养箱、流式细胞仪、电泳凝胶图像分析系统以及聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。
1.2 研究方法
研究过程包括细胞培养、细胞转染以及效果检测、细胞凋亡检测、Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。(1)细胞培养。取出心肌细胞冻存管放入37℃水中解冻，并要轻轻晃动冻存管，加速解冻过程。解冻完成后，将心肌细胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中进行培养，培养条件为：37℃、5%CO2以及饱和湿度为95%的恒温培养箱。第二天更换培养液。按照实验需要传代，选取对数生长期的细胞进行研究。(2)细胞转染及效果检测。以1×105个/孔对生长至对数期的心肌细胞进行接种，使用的细胞培养板为6孔。细胞生长密度达到60%时，要及时更换培养基，对空白试剂组、阴性病毒组以及Fgl2 siRNA组对心肌细胞的感染程度进行检测。取48小时后的细胞，向内加入PMSF和RIPA裂解液，然后放在4℃冰上反应30分钟，使用每分钟12000转的离心15分钟，收集蛋白。用BCA试剂盒对蛋白进行定量。然后取出50微克蛋白样品使用12%十二烷基硫酸与聚丙烯酰胺凝胶电泳仪进行分离，电泳结束后使用PVDF转膜、5%脱脂奶粉进行封闭，加入一抗(1：400稀释的Fgl2和1：1000稀释的GAPDH)，放置于4℃环境中孵育。第二天用TBST洗膜(3次，每次5分钟)，然后加入1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记过的羊抗鼠IgG，在室温中孵育1小时，再次进行TBST洗膜，利用ECL化学发光剂显色，在室温避光环境中完成显影与定影。以GAPDH为参照，对Fgl2的蛋白表达水平进行对比分析。(3)細胞凋亡检测。主要利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测，然后对心肌细胞的凋亡率进行计算分析。(4)Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。取出经过转染培养的各组细胞，利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行检测，然后检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。
2 研究结果
使用SPSS21.0软件对研究资料进行差异比较，两组比较结果用t检验。此次研究中，空白对照组、阴性病毒对照组以及Fgl2 siRNA组的结果分别为：(1)Fgl2蛋白表达水平。空白对照组与阴性病毒组的蛋白表达为[(0.445±0.051)VS(0.442±0.050)]，差异不具有统计学意义；而Fgl2 siRNA组的蛋白表达水平为(0.182±0.028)，明显低于空白对照组与阴性病毒组，具有统计学意义。(2)心肌细胞凋亡情况。空白对照组与阴性病毒组的细胞凋亡分别为[(1.25±0.28)%]、[(1.24±0.29)%]，而Fgl2 siRNA组的细胞凋亡为[(5.76±0.57)%]，降低趋势明显。(3)酶切easpase3，Noteh1，Hesl蛋白表达情况。Fgl2 siRNA组的酶切easpase3蛋白明显下调表达，而Notchl，Hesl蛋白明显上升。
3 结论
一直以来心血管疾病都是威胁人类健康的重要疾病，而患者在发病过程中因心肌缺血缺氧导致心肌细胞凋亡、心室扩张、心脏重塑等症，最终导致患者心力衰竭。本次研究显示，沉默Fgl2表达可以明显降低H9C2细胞的凋亡。而caspase家族是细胞凋亡的重要通路，其中caspase3是多种凋亡刺激信号的最终汇集点，它的活性是细胞凋亡进行不可逆阶段的标志，根据研究发现下调easpase3表达能够降低心肌细胞的凋亡。所以，沉默Fgl2表达可以借助抑制酶切easpase3表达实现降低心肌细胞凋亡的目的。而Fgl2表达激活Notch1信号通路，可以限制心肌细胞的凋亡，为治疗心血管疾病提供理论基础。
参考文献
俞芽法，郑振中.Fgl2-shRNA基因沉默对糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形态变化[J].西安交通大学学报(医学版)，2015，36(5)：605-608.
杨东艳，李刚，张蕾，等.C3G基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响[J].解放军医学杂志，2015，40(8)：603-609.
SOX6 and PDCD4 enhance cardiomyocyte apoptosis through LPS-induced miR-499 inhibition.Jia Z，Wang J，Shi Q，et al.Apoptosis .2016
Overexpression of Fibrinogen-Like Protein 2 Promotes Tolerance in a Fully Mismatched Murine Model of Heart Transplantation.Bartczak A，Chruscinski A，Mendicino M，et al.American Journal of Transplantation .2016
Association of Soluble Fibrinogen-like Protein 2with the Severity of Coronary Artery Disease.Cheng J，Chen Y，Xu B，et al.Journal of Internal Medicine .2016, http://www.100md.com(肖懿峰 袁逸铭)
【关键词】Fgl2基因；心肌细胞；凋亡影响；纤维蛋白原样
【中图分类号】R542.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2018)06-03--01
经过相关的医学研究发现，心肌疾病中都会出现心肌细胞凋亡，而心肌细胞凋亡会引起各种慢性心力衰竭、心室重塑等病症。因此，抑制心肌细胞凋亡对心肌疾病具有一定的预防效果。对心肌细胞凋亡进行抑制可以改善心肌生存环境，减轻心脏重塑，有助于心肌疾病的后续治疗。而Fgl2基因是一种纤维蛋白原样，主要表达在T细胞、巨噬细胞以及内皮细胞中，它是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要功能为调节免疫与凝血。
1 研究材料与研究方法
1.1 研究材料
此次试验研究过程中主要使用的研究材料为H9C2心肌细胞株，是从中国科学院细胞库中选购的。研究过程中使用的主要研究试剂包括：(1)RPMI1640培养基与胎牛血清；(2)阴性病毒、Fgl2 siRNA慢病；(3)二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒以及电化学发光(ECL)试剂盒；(4)细胞凋亡试剂盒、酶切caspase3、Notch1以及Hesl抗体。而研究中使用的仪器主要有：CO2细胞培养箱、流式细胞仪、电泳凝胶图像分析系统以及聚丙烯酰胺凝胶电泳仪。
1.2 研究方法
研究过程包括细胞培养、细胞转染以及效果检测、细胞凋亡检测、Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。(1)细胞培养。取出心肌细胞冻存管放入37℃水中解冻，并要轻轻晃动冻存管，加速解冻过程。解冻完成后，将心肌细胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中进行培养，培养条件为：37℃、5%CO2以及饱和湿度为95%的恒温培养箱。第二天更换培养液。按照实验需要传代，选取对数生长期的细胞进行研究。(2)细胞转染及效果检测。以1×105个/孔对生长至对数期的心肌细胞进行接种，使用的细胞培养板为6孔。细胞生长密度达到60%时，要及时更换培养基，对空白试剂组、阴性病毒组以及Fgl2 siRNA组对心肌细胞的感染程度进行检测。取48小时后的细胞，向内加入PMSF和RIPA裂解液，然后放在4℃冰上反应30分钟，使用每分钟12000转的离心15分钟，收集蛋白。用BCA试剂盒对蛋白进行定量。然后取出50微克蛋白样品使用12%十二烷基硫酸与聚丙烯酰胺凝胶电泳仪进行分离，电泳结束后使用PVDF转膜、5%脱脂奶粉进行封闭，加入一抗(1：400稀释的Fgl2和1：1000稀释的GAPDH)，放置于4℃环境中孵育。第二天用TBST洗膜(3次，每次5分钟)，然后加入1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记过的羊抗鼠IgG，在室温中孵育1小时，再次进行TBST洗膜，利用ECL化学发光剂显色，在室温避光环境中完成显影与定影。以GAPDH为参照，对Fgl2的蛋白表达水平进行对比分析。(3)細胞凋亡检测。主要利用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测，然后对心肌细胞的凋亡率进行计算分析。(4)Wsetern印迹检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。取出经过转染培养的各组细胞，利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行检测，然后检测酶切caspase3、Notch1以及Hesl的蛋白表达。
2 研究结果
使用SPSS21.0软件对研究资料进行差异比较，两组比较结果用t检验。此次研究中，空白对照组、阴性病毒对照组以及Fgl2 siRNA组的结果分别为：(1)Fgl2蛋白表达水平。空白对照组与阴性病毒组的蛋白表达为[(0.445±0.051)VS(0.442±0.050)]，差异不具有统计学意义；而Fgl2 siRNA组的蛋白表达水平为(0.182±0.028)，明显低于空白对照组与阴性病毒组，具有统计学意义。(2)心肌细胞凋亡情况。空白对照组与阴性病毒组的细胞凋亡分别为[(1.25±0.28)%]、[(1.24±0.29)%]，而Fgl2 siRNA组的细胞凋亡为[(5.76±0.57)%]，降低趋势明显。(3)酶切easpase3，Noteh1，Hesl蛋白表达情况。Fgl2 siRNA组的酶切easpase3蛋白明显下调表达，而Notchl，Hesl蛋白明显上升。
3 结论
一直以来心血管疾病都是威胁人类健康的重要疾病，而患者在发病过程中因心肌缺血缺氧导致心肌细胞凋亡、心室扩张、心脏重塑等症，最终导致患者心力衰竭。本次研究显示，沉默Fgl2表达可以明显降低H9C2细胞的凋亡。而caspase家族是细胞凋亡的重要通路，其中caspase3是多种凋亡刺激信号的最终汇集点，它的活性是细胞凋亡进行不可逆阶段的标志，根据研究发现下调easpase3表达能够降低心肌细胞的凋亡。所以，沉默Fgl2表达可以借助抑制酶切easpase3表达实现降低心肌细胞凋亡的目的。而Fgl2表达激活Notch1信号通路，可以限制心肌细胞的凋亡，为治疗心血管疾病提供理论基础。
参考文献
俞芽法，郑振中.Fgl2-shRNA基因沉默对糖尿病大鼠心功能的改善及心肌病理形态变化[J].西安交通大学学报(医学版)，2015，36(5)：605-608.
杨东艳，李刚，张蕾，等.C3G基因对H9C2心肌细胞凋亡和增殖的影响[J].解放军医学杂志，2015，40(8)：603-609.
SOX6 and PDCD4 enhance cardiomyocyte apoptosis through LPS-induced miR-499 inhibition.Jia Z，Wang J，Shi Q，et al.Apoptosis .2016
Overexpression of Fibrinogen-Like Protein 2 Promotes Tolerance in a Fully Mismatched Murine Model of Heart Transplantation.Bartczak A，Chruscinski A，Mendicino M，et al.American Journal of Transplantation .2016
Association of Soluble Fibrinogen-like Protein 2with the Severity of Coronary Artery Disease.Cheng J，Chen Y，Xu B，et al.Journal of Internal Medicine .2016, http://www.100md.com(肖懿峰 袁逸铭)