浅谈实时荧光定量PCR实验污染问题及对策
[关键词] 污染；原因；预防；处理
实时荧光定量PCR技术是一种利用不同的荧光检测方法来定量核酸的技术，具有高度的灵敏性、特异性和精确性。现在已广泛应用临床进行病毒的定量检测，但令人头痛的仍是污染问题。就此问题浅谈一下自己的观点。
1.污染原因
1.1标本间交叉污染
1.1.1收集标本的容器被污染；
1.1.2标本溢出于容器外，造成标本间的交叉污染；
1.1.3加样枪污染，多是气溶胶污染导致标本间的交叉污染；
1.2试剂污染
试剂配制过程中，由于加样枪、容器、蒸馏水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
1.3扩增产物污染
最常见的污染问题，单人单管实现完全闭管减少了这个的问题发生，但是不能完全杜绝，如有破管或是管盖密封不好，极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
2.污染的监测，寻找污染源，做对照实验
2.1监测实验室不同分区的空气是否被污染，每次实验带一个空气对照，将扩增管打开盖在空气中放置1小时，地点可不固定；
2.2监测加样枪是否被污染，每次实验做一个加样枪的对照，取无污染容器盛装少量蒸馏水，将使用的加样器在蒸馏水中吹打后，取少量液体加入扩增管中；
2.3监测试剂是否被污染，每盒试剂均有阴性对照，将阴性对照按样本制备后扩增。
2.4监测仪器表面是否被污染，如果排除以上三种情况，实验仍有污染，考虑可能的环境污染中常见的污染源主要有离心机、冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；取无污染容器盛装少量蒸馏水，用无菌棉签擦拭仪器表面，取少量液体加入扩增管中；
3.污染的预防
3.1严格划分操作区，常见的分区类型有试剂准备区、标本处理区、扩增分析区三区，每区有明显的标识，工作严格区别，操作器材专用，并有一定的方向性。
3.2选用无污染的一次性耗材，如手套、枪头等
3.3在实验分析的前、中、后的每个环节，操作人员应谨慎认真，严格按照实验室各项规章制度及标准的操作规程进行操作，避免交叉污染。
4.污染处理
4.1稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
4.2紫外照射(UV)法：紫外波长(nm)一般选择254/300nm，照射30min即可。。
4.3每天都打开整个PCR实验室的门窗和排气扇，让整个实验室通风，严禁外来人员。
参考文献：
[1]姚远，张国富，刘玉英.PCR污染与对策及假阴性原因.实用医技杂志，2002，9(4)：276—277.
[2]朱平.PCR基因扩增实验操作手册[M].北京：中国科学技术出版社，1992：71., 百拇医药(王芳)
实时荧光定量PCR技术是一种利用不同的荧光检测方法来定量核酸的技术，具有高度的灵敏性、特异性和精确性。现在已广泛应用临床进行病毒的定量检测，但令人头痛的仍是污染问题。就此问题浅谈一下自己的观点。
1.污染原因
1.1标本间交叉污染
1.1.1收集标本的容器被污染；
1.1.2标本溢出于容器外，造成标本间的交叉污染；
1.1.3加样枪污染，多是气溶胶污染导致标本间的交叉污染；
1.2试剂污染
试剂配制过程中，由于加样枪、容器、蒸馏水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
1.3扩增产物污染
最常见的污染问题，单人单管实现完全闭管减少了这个的问题发生，但是不能完全杜绝，如有破管或是管盖密封不好，极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。
2.污染的监测，寻找污染源，做对照实验
2.1监测实验室不同分区的空气是否被污染，每次实验带一个空气对照，将扩增管打开盖在空气中放置1小时，地点可不固定；
2.2监测加样枪是否被污染，每次实验做一个加样枪的对照，取无污染容器盛装少量蒸馏水，将使用的加样器在蒸馏水中吹打后，取少量液体加入扩增管中；
2.3监测试剂是否被污染，每盒试剂均有阴性对照，将阴性对照按样本制备后扩增。
2.4监测仪器表面是否被污染，如果排除以上三种情况，实验仍有污染，考虑可能的环境污染中常见的污染源主要有离心机、冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；取无污染容器盛装少量蒸馏水，用无菌棉签擦拭仪器表面，取少量液体加入扩增管中；
3.污染的预防
3.1严格划分操作区，常见的分区类型有试剂准备区、标本处理区、扩增分析区三区，每区有明显的标识，工作严格区别，操作器材专用，并有一定的方向性。
3.2选用无污染的一次性耗材，如手套、枪头等
3.3在实验分析的前、中、后的每个环节，操作人员应谨慎认真，严格按照实验室各项规章制度及标准的操作规程进行操作，避免交叉污染。
4.污染处理
4.1稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；
4.2紫外照射(UV)法：紫外波长(nm)一般选择254/300nm，照射30min即可。。
4.3每天都打开整个PCR实验室的门窗和排气扇，让整个实验室通风，严禁外来人员。
参考文献：
[1]姚远，张国富，刘玉英.PCR污染与对策及假阴性原因.实用医技杂志，2002，9(4)：276—277.
[2]朱平.PCR基因扩增实验操作手册[M].北京：中国科学技术出版社，1992：71., 百拇医药(王芳)