结核分枝杆菌rpoB基因突变检测(2)
扩增后的基因产物分别进行琼脂糖凝胶电泳。方法：将新倒好的凝胶放入电泳槽中，加样孔一侧放在负极端(共8孔)，向第一孔加入5?l DNA Marker，其余加样孔中分别加入DNA扩增产物5?l。通电，120V，100mA，电泳30分钟。电泳完成后将胶板放入凝胶成像仪(Bio-Rad)中，观察电泳条带的清晰程度以及位置。确认基因的存在。对电泳成功剩余的扩增产物装进EP管内，做好基因以及标本号的标记并用封口膠封住。放入冰箱保存，待下一步的序列分析。
2.4 PCR产物凝胶回收
PCR产物和酶切产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒，根据说明书提供的方法进行产物回收。
2.5对扩增基因产物进行序列比对及分析
将纯化后的PCR扩增产物送交由成都擎科梓熙生物技术有限公司进行DNA测序，将测序结果用软件与PUBMED BLAST的rpoB基因标准序列比较分析，确定突变位点和类型。
3 结果
3.1 pcr扩增结果
如图(1)，预实验选取1000bpDNA ladder做为makker，第二孔为阴性对照孔，后面依次为随机选择的标本。可以看出makker和部分标本是能扩增出条带的，实验条件是可行的，可以继续进行实验。
30例结核DNA阳性标本中，有25例rpoB 基因PCR 扩增阳性者， 将这25例pcr条带进行提纯。提纯后的标本送至成都擎科梓熙生物公司进行测序。
Lane 1： 1000bp DNA Ladder Lane 2： 结核DNA阴性的标本
Lane 3：标本3-2 Lane 4：标本3-1
Lane 5：标本2-1 Lane 6：标本2-2
Lane 7：标本2-3 Lane 8：标本2-4
431
3.2 测序结果
实验扩增产物在预实验成功后进行封存，交由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。序列结果如期返回，其结果显示有18例扩增产物都可以得到基因有效序列，截取每个基因在长度0-350bp区间的序列图，分析结果如下。
3.3 比对结果
对包含RRDR 耐药决定区的305 bp rpoB 基因扩增片段进行DNA 测序。如表1
3 讨论
利福平(RFP)，是常用的一线抗结核药物之一。利福平通过和结核菌中DNA转录依赖的RNA聚合酶的结合来抑制转录过程，导致细胞死亡[3]。耐药结核的出现常常导致结核患者治疗的失败与死亡，快速检测结核药敏，对结核患者临床用药有十分重要的指导意义。本文对标本进行rpoB 基因PCR 扩增和测序共需时间3 天。耗时远较常规方法为短。为结核病患者在第一时间合理治疗赢得了宝贵时间。将分子学方法与快速药敏实验相结合，为临床提供快速的用药指导具有重要意义。
参考文献
2.4 PCR产物凝胶回收
PCR产物和酶切产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒，根据说明书提供的方法进行产物回收。
2.5对扩增基因产物进行序列比对及分析
将纯化后的PCR扩增产物送交由成都擎科梓熙生物技术有限公司进行DNA测序，将测序结果用软件与PUBMED BLAST的rpoB基因标准序列比较分析，确定突变位点和类型。
3 结果
3.1 pcr扩增结果
如图(1)，预实验选取1000bpDNA ladder做为makker，第二孔为阴性对照孔，后面依次为随机选择的标本。可以看出makker和部分标本是能扩增出条带的，实验条件是可行的，可以继续进行实验。
30例结核DNA阳性标本中，有25例rpoB 基因PCR 扩增阳性者， 将这25例pcr条带进行提纯。提纯后的标本送至成都擎科梓熙生物公司进行测序。
Lane 1： 1000bp DNA Ladder Lane 2： 结核DNA阴性的标本
Lane 3：标本3-2 Lane 4：标本3-1
Lane 5：标本2-1 Lane 6：标本2-2
Lane 7：标本2-3 Lane 8：标本2-4
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3.2 测序结果
实验扩增产物在预实验成功后进行封存，交由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。序列结果如期返回，其结果显示有18例扩增产物都可以得到基因有效序列，截取每个基因在长度0-350bp区间的序列图，分析结果如下。
3.3 比对结果
对包含RRDR 耐药决定区的305 bp rpoB 基因扩增片段进行DNA 测序。如表1
3 讨论
利福平(RFP)，是常用的一线抗结核药物之一。利福平通过和结核菌中DNA转录依赖的RNA聚合酶的结合来抑制转录过程，导致细胞死亡[3]。耐药结核的出现常常导致结核患者治疗的失败与死亡，快速检测结核药敏，对结核患者临床用药有十分重要的指导意义。本文对标本进行rpoB 基因PCR 扩增和测序共需时间3 天。耗时远较常规方法为短。为结核病患者在第一时间合理治疗赢得了宝贵时间。将分子学方法与快速药敏实验相结合，为临床提供快速的用药指导具有重要意义。
参考文献
[1] 糜祖煌， 秦玲.结核分支杆菌3 种不同靶基因传统PC R、巢式PC R 检测比较研究.中国优生与遗传杂志， 2002 ， 10(1)：28 -30
[2] 李国利. 结核分枝杆菌耐药分子机制及耐药基因检测方法研究进展[J]. 中国医师杂志， 2002， 4(4)： 338-342.
[3] 李群， 王晓萌. WHO 浙江省结核病耐药监测研究报告[J]. 中华结核和呼吸杂志， 2000， 23(12)： 718-721., 百拇医药(尹冬梅)