miR—205—5p对鼻咽癌细胞系增殖、迁移和侵袭的影响及其机制(2)
1.6 Western blot檢测PTEN、AKT和Smad4蛋白表达
收集转染72 h后的细胞，提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取50 μg蛋白在100 g/L SDS-PAGE凝胶上电泳，总蛋白分离后，转至PVDF膜上。于摇床上用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1～2 h(磷酸化蛋白使用牛血清清蛋白封闭，其余步骤相同)，加入一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜，采用TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000稀释)，室温反应2 h，以TBST洗膜3次。用发光试剂ECL(A液和B液)进行显色，暗室曝光并保存图片。应用Image J软件进行条带灰度分析，目的蛋白相对表达量以目的条带灰度值/β-actin条带灰度值表示。
1.7 统计学分析
应用SSPS 17.0统计软件进行分析，计量资料数据以[AKx-D]±s表示，组间比较采用t检验或t′检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 转染细胞中miR-205-5p的表达水平
miR-205 mimics组细胞中miR-205-5p的表达量比mimics NC组增加约90倍 ......
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