松针油引起人乳腺癌MCF7凋亡、自噬的机制研究(2)
2.4 P53基因检测及LC3-II蛋白取以上细胞108个,1000r/min,离心10min后,丢弃上清,PBS洗涤后,加入鼠抗人P53 2FITCul在室温下避光保存30min,用流式细胞仪进行测试。
2.5 端粒酶活性检测
根据PRAP的原理,按PRAP-PCR端粒酶检测试剂盒的说明进行端粒酶活性的检测。MCF7细胞提取物以考马斯亮蓝蛋白定量法进行蛋白定量的提取,各组提取的蛋白含量相一致,将等量细胞提取物加入TRAP反应体系中,用30℃孵化30min,使端粒酶延长TS引物,然后进行三步的PCR(94℃,5s;59℃,44s)循环30次,用10%的非变性PAGE进行PCR产物分析,用硝酸银染色凝胶后观察并摄像,测定波长在450nm和690nm的吸光度的D值,后根据△D=D450-D690,并计算。
2.6 MDC荧光法检测乳腺癌细胞自噬
药物处理后,取1ml/L加入1ul MDC(50umol/L)染液,37℃反应10min,去掉上清夜,用1×PBS漂洗3次,用356nm发射滤片和545nm阻断滤片,用荧光显微镜观察细胞,并且拍照,细胞内的蓝色亮亮的颗粒为自噬泡,含有10或以上的荧光颗粒细胞为自噬泡阳性细胞 ......
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