补肾填精含药血清对成骨细胞增殖\分化及碱性磷酸酶活性检测的研究(2)
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参见附件。
1.3 药物及含药血清制备:
①福善美，杭州默沙东制药有限公司生产，用量：70mg/片，每周一片，生产批号：120511；②金刚健骨片，由补骨脂、熟地黄、川牛膝、鹿角胶、菟丝子、肉苁蓉、杜仲、粉萆、山药组成，购自湖南中医药大学附属第一医院药剂科，用量：0.3g/片，一次10片，一日3次，生产批号：20120924；③骨松宝，由淫羊藿、赤芍、三棱、莪术等组成，贵州富华药业有限责任公司生产，用量，0.5g/粒，一次2粒，一日3次，生产批号：20120503；④生理盐水购自国药集团。
以上药物按照人与大鼠剂量换算公式折算为大鼠每天的等效剂量，连续灌胃2次，间隔2次，于末次给药1h后，以3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后经腹主动脉采取全血，室温静置2小时后以1500rpm离心20min，吸出上层血清，一次性滤器抽滤除菌，56℃灭活30min后分装待用，保存于-80℃冰箱。
1.4 成骨细胞的体外提取及培养:
取新生24h内SD大鼠5只，浸没于75%酒精10min，脱颈处死后在无菌条件下分离大鼠颅盖骨；PBS反复清洗以清除骨片表面附着的血管、粘膜等结缔组织；以眼科剪将骨组织剪碎，碎片约1mm3；以5ml 0.25%胰蛋白酶将骨片消化20min；弃胰蛋白酶消化液，加入5ml 0.1%I型胶原蛋白酶37℃恒温气浴震荡消化45min，收集上清液，转移至新的离心管，1000r/min离心5min；将剩余骨片在0.1%I型胶原蛋白酶中重复消化2次，1000r/min离心5min；将三次所得细胞以MEM培养液(含15%FBS)反复吹打混匀，制成细胞悬液，以105/ml的密度接种于25cm2培养瓶中，置于5%CO2培养箱中37℃培养；每天于倒置显微镜下观察细胞生长状态，隔天换液一次。当细胞生长至汇合时，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1:3传代培养，第三代细胞用于后续实验。
1.5 实验分组及干预方案:
本研究共分四组：①福善美组(10%福善美含药血清+MEM培养基+双抗)②金刚健骨片组(10%金刚健骨片含药血清+MEM培养基+双抗)③骨松宝组(10%骨松宝含药血清+MEM培养基+双抗)④对照组(10%生理盐水含药血清+MEM培养基+双抗)
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