●许朋 余兰 冯昆

    一种快速提取质粒DNA的方法

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    分子生物学技术发展迅猛，提取质粒DNA方法向着高通量、快速高效、广泛适用的方向发展。本实验采用二氧化硅修饰的磁珠设计了一种快速分离质粒DNA的试剂盒，并设计了多种引物，探索同一质粒DNA对两对引物，同一基因组DNA对两对引物进行PCR验证。结果表明：含磁性磁珠的试剂盒能够在10min内完成提取，产量较高；且样品对PCR无抑制作用，并适用于多种样品，应用此方法提取的DNA还可用于多重PCR。

    提取；质粒

    质粒是独立于染色体外并以超螺旋状态于细菌和酵母等多种生物中的环状的DNA分子。也是基因工程主要载体，在医学领域、分子生物学领域、免疫检验领域具有广泛的应用。碱裂解法、酚裂解法、煮沸法是传统的提取质粒DNA的方法，但传统的方法中使用了有多种有毒试剂、提取效率不稳定、步骤繁琐而且耗时长[6]。

    随后发展了阴离子交换层析、疏水层析法和凝胶层析等方法，但是耗时且昂贵，不易实现自动化。因此寻求一种稳定、高效、高通量、安全环保、自动化DNA提取方法越来越重要。

    随着纳米技术的发展，磁性纳米微球近几年来成为分子生物学领域瞩目的新星，其表面可以被多种活性基团包被修饰，表面积大，在磁场下的超顺磁作用等使得其应用广泛[9]。本实验针对质粒DNA的提取，探索采用二氧化硅包被的磁性磁珠，在传统的试剂盒原理上，通过提取体系的优化，探索并设计多种引物用于PCR验证并适用，建立了高效、快速、安全、普适的质粒DNA提取方法，为质粒的提取分离纯化提供进一步的依据。

    1 材料与方法

    1.1 实验菌种：大肠杆菌的质粒pEGFP-N1来自实验室自存

    1.2 实验试剂：盐酸胍、Rnase酶、胰蛋白胨、柠檬酸钠、乙酸钾、β一巯基乙醇、羧苄青霉素、吐温-20、无水乙醇、异丙醇、Tris碱、硼酸、酵母浸出液、溴化乙锭，LIris—HCl、RNase A、SDS、NaOH、KAc、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)

    1.3 实验仪器：微型分光光度计Nanodrop ND—2000、凝胶成像系统、混合反应器、磁性分离架、恒温电热股风干燥箱、酸度计、水平电泳仪、PCR扩增仪、漩涡混合器、电热恒温振荡水槽、台式高速离心机

    1.4 实验方法

    1.4.1 质粒DNA提取

    1)选取单菌落在3mL LB培养液(pH 7.0-7.2 ......