酵母分泌表达重组人神经生长因子
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摘要：目的研究人神经生长因子基因工程制备工艺。方法构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF，转化毕赤酵母，筛选多拷贝转化子，进行摇瓶表达，正交试验选择表达条件。结果得到高表达高外泌的工程菌，并确定了纯化步骤，经疏水层析和阳离子交换层析纯化后，取得高活性高纯度的rhNGF。结论为该药的规模生产奠定了基础。
关键词：重组人神经生长因子；毕赤酵母；分泌表达
中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0009-03
Expression and Secretion of Recombinant Human Nerve Growth Factor in Yeast
WANG Ge, WANG Yan, SUN Hai-bo, HE Ling-bing, ZHU Yi-song, WANG Jun-yan
(Shandong Younglong Biotech. Co., Ltd., Jinan 250101, China)
Abstract：Objective To study the genetic preparation of human nerve growth factor (hNGF). Methods The efficient expression plasmid was constructed and transformed into Pichiapastoris, which was applied for screening of multicopy converter and expression with shake flask by orthogonal test. Results The engineering strain with high-level expression and secretion was obtained. Fermentation and purification was performed by hydrophobic chromatography and basic ion exchange laminar analysis in order to obtain pure and active recombinant human nerve growth factor (rhNGF). Conclusion The study lays a foundation for the large-scale production of rhNGF.
Key words：rhNGF;Pichiapastoris; expression and secretion
人神经生长因子(human nerve growth factor， hNGF)是人体中一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向[1]。对促进大脑的发育、神经系统的生长、损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。hNGF可应用于糖尿病性周围神经病变、老年痴呆症、帕金森氏症、面神经炎及神经损伤(包括周围神经损伤)等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。hNGF在人体中含量甚微，天然来源几乎不可能。因此，用基因工程的方法生产重组人神经生长因子(rhNGF)是唯一的选择[2]。为此，我们尝试了将人神经生长因子基因在酵母中的表达。
1材料和方法
1.1菌株
通过全基因合成得到人神经生长因子(hNGF)的全基因片断[3]，将该基因片段插入到含有AOX1启动子和分泌信号肽序列的载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPIC9K/rhNGF，转化PichiapastorisGS115宿主菌。通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His+ Mut+表型转化子，并在2.0 mg/mL G418平板上筛选得到多拷贝转化子[4]。摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析[5]，结果表明重组蛋白质相对分子质量13.6×103，能与特异性抗体发生免疫反应；鸡胚背神经节法测rhNGF活性[6]，结果显示表达活性可达104 U/mL。
1.2方法
1.2.1蛋白表达条件的优化根据影响酵母表达的各种关键因素(表1)，设计了正交试验选择表达条件。
表1 酵母表达正交试验的各关键因素及试验水平
1.2.2工程菌的发酵培养及蛋白表达取液氮保存甘油管菌株，取适量无菌操作涂布于YPD平板上，30 ℃条件下倒置培养活化24 h。取活化平板上3～5个单菌落，接于BMG摇瓶，30 ℃，200 r/min摇床培养24h。以0.5%比例转接入二级BMG培养基，30 ℃摇床200 r/min培养24 h，当菌密度达1.0～1.3时，以10%比例接于有BMG培养基的发酵罐中，30 ℃条件下发酵培养 ......
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