菠萝蛋白酶
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摘要：对菠萝蛋白酶的生产方法、理化性质与分离纯化进行了介绍。
关键词：菠萝蛋白酶；综述
中图分类号：Q55文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0026-03
Intro duction to Bromelain
LI Nai-cheng1, He Yan-li2, Li Pei-xue1,2, Zhang Tian-min1
(1.School of Pharmaceutical Science, Shandong University, Jinan 250012, China; 2.Shandong Bausch & Lomb Freda Phar. Co., Ltd., Jinan 250014, China)
菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝的果实和茎中制取分离出的蛋白水解酶的总称，根据制取分离部位的不同，分为果菠萝蛋白酶(fruit bromelain)和茎菠萝蛋白酶(stem bromelain)。1891年，Chittenden等首先用硫酸铵沉淀法从菠萝果实中分离出了果菠萝蛋白酶。1957年，Heineche等[1]从菠萝茎中制取蛋白水解酶，从此菠萝蛋白酶实现了商品化生产。
菠萝蛋白酶中含有多种不同蛋白水解酶组分，对多种蛋白质及多肽具有催化水解活性，在医药上主要用于抗炎、消除水肿、烧伤后脱痂等；食品工业上用于啤酒澄清、肉类嫩化及水解蛋白的生产等。本文对菠萝蛋白酶的生产方法、理化性质及分离纯化方面的研究情况进行介绍。
1生产方法
Heineche等将菠萝茎榨汁离心后用丙酮沉淀法获得了粗酶，其中含有50%蛋白质，10%～15%的非有机成分，还有一些复杂的糖。现在工业化生产方法主要有以下2种[2]。
(1)白陶土吸附法
(2)鞣酸吸附法
王平诸等[3]曾用一种工艺生产菠萝蛋白酶，将除去杂质后的菠萝茎澄清汁液用PSA(聚砜酰胺)膜浓缩至原体积的1/5，再用95%乙醇进行沉淀，结果酶的活性和收率都得到提高。
菠萝蛋白酶生产过程中，为了不破坏酶活性，防止酶的自身水解作用，温度一般控制在0～4℃，另外常加入一些活性保护剂，如维生素C、依地酸二钠、半胱氨酸等。林韶湘等[4]在制取分离过程中用依地酸二钠、醋酸锌、氯化钠、维生素C可使茎菠萝蛋白酶活性比未加入时提高93.88%，而制取分离时加入1%半胱氨酸或1%硫代硫酸钠作为抗氧化剂可使果菠萝蛋白酶和茎菠萝蛋白酶活性分别提高35.51%和69.06%。
2理化性质
Murachi等[5]对用阴离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯的菠萝蛋白酶进行了理化性质的研究，所得到的菠萝蛋白酶中含有2.1%的糖成分，有4个N-乙酰化的氨基己糖，等电点为9.55，分子中有285个氨基酸残基，其中有25个酸性氨基酸，根据氨基酸组成计算出的氮含量为15.88%。用超速离心法测得的相对分子质量为33 200，与通过分子结构计算出的相对分子质量相一致。酶溶液最大吸收波长为280 nm，最小吸收波长为254 nm，0.051%浓度的酶溶液280 nm的吸收值为0.984。
以后的许多研究者在Murachi等的研究基础上对菠萝蛋白酶的理化性质进行了研究，包括氨基酸组成、糖分子结构及酶的蛋白水解活性等，并对其中不同组分的理化性质进行了比较。
Ritonja等[6]通过研究排列出菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，表明菠萝蛋白酶是木瓜酶系中的一种。其氨基酸有20种，共212个，计算得出的相对分子质量是22 828，加上糖部分的相对分子质量1 000得出酶的相对分子质量是23 828。N端的氨基酸是丙氨酸(Ala)，C端的氨基酸是谷氨酸(Glu)。
菠萝蛋白酶是一种糖蛋白，分子结构中有一个寡糖分子，由甘露糖(mannose, Man)，岩藻糖(fucose, Fuc)，木糖(xylose, xyl)和N-乙酰葡糖胺(N-aceltylglucosamine, GlcNAC)组成，共价连接在肽链上，Yasuda等[7]根据研究推测糖分子的结构如图1。
图1Yasuda等推测的糖分子结构
而Ishihara等[8]对酶水解后获得了2种寡糖分子，其结构如图2。
图2Ishihara等分离出的2种糖分子的结构
Yasuda等[9]将菠萝蛋白酶用连四硫酸钠(Na2S4O6)保护分子中的SH基团，过碘酸钠氧化糖分子，在反应1，3，5 h后，未被氧化的糖分子分别剩余20%，5%，2%，而对酪蛋白活性分别保持了83%，72%和64%，说明酶分子结构中糖分子不是催化所必需的基团。
菠萝蛋白酶分子中SH基团是催化水解活性基团，它位于从N端开始的第25个氨基酸，陈清西等[10]研究后认为：巯基、氨基、色氨酸(Trp)残基和唯一的组氨酸(His)残基是酶催化活性必需基团，而羧基和羟基与酶活性无关，酶中的6个色氨酸残基仅有1个是酶活性所必需的。
在丙酮提取的菠萝蛋白酶粉末中，含有能抑制酶活性的小分子蛋白质，Reddy等[11]测定出这些蛋白质的氨基酸组成，相对分子质量约为5 600。木瓜蛋白酶抑制剂E64[L-trans-epoxysuccinyl-leucylamido (4-guanidino)-butane]和鸡蛋清蛋白也可抑制菠萝蛋白酶，但由于分子结构上的不同，这2种物质对菠萝蛋白酶的抑制程度要比对木瓜蛋白酶弱[6]。兔血清与人血清对菠萝蛋白酶活性也有一定的抑制作用。
菠萝蛋白酶对多种天然蛋白质和合成多肽具有催化水解作用，天然底物有酪蛋白、明胶等，合成底物有Z-P1-P2(Z：苯甲氧基；P1、P2：氨基酸)形式的肽及其它各种多肽。实验已经证明，酶活性的强弱与酶的各种药理作用有关，如由于酶的蛋白水解作用 ......
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