微生物产弹性蛋白酶
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摘要：综述了微生物产弹性蛋白酶的国内外研究进展及应用前景。
关键词：微生物；弹性蛋白酶；发酵
中图分类号：Q556+.9文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0050-04
Progress in Microbial Production of Elastase
FANG Shang-ling, HU Jia-jun
(College of Biochemical Engineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)
弹性蛋白酶(elastase)是一种以分解不溶性弹性蛋白质为特征的广谱蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏中，以及皮肤、主动脉、血小板和白血球中。在微生物类群中也广有分布，细菌、放线菌、真菌中都有分泌胞外弹性蛋白酶的报道[1]。弹性蛋白酶可由动物胰脏提取或由微生物发酵制得[2]。由动物提取纯化的弹性蛋白酶是一种肽链内切酶，由240个氨基酸残基组成，相对分子质量为25 900，等电点为pI 9.5[3]。来源不同的微生物弹性蛋白酶都能降解其天然底物——弹性硬蛋白质。同功不同源蛋白酶的特点、性质、相对分子质量和等电点等有所差异，但都是一种广谱的肽链内切酶，具有较广泛的水解特性[4]。
目前，弹性蛋白酶主要作为治疗高脂血症、防治动脉粥样硬化症的生化药物，治疗确切，安全可靠。我国生产弹性蛋白酶主要由猪胰脏提取，原料来源有限制，且酶含量不高，每1 kg鲜胰脏含弹性蛋白酶仅210 000 U，限制了生产的发展。微生物弹性蛋白酶与胰弹性蛋白酶一样，具有较广的水解特性，不但能降解弹性蛋白，而且能分解酪蛋白、明胶、血纤维蛋白、血红蛋白、白蛋白等多种蛋白质，是一种广谱的肽链内切酶。国外，药用弹性蛋白酶有通过动物胰脏提取，也有发酵生产，其效果相似[1]。利用微生物发酵大规模工业化生产弹性蛋白酶不仅能提供足够的治疗用药物酶，也能为开拓该酶其他方面的应用提供充足的酶源。
1微生物来源弹性蛋白酶的国内外研究情况
弹性蛋白酶最初是1949年由Balo等从胰脏中分离纯化出来，并指出其含量水平与动脉粥样硬化症有关。从此对该酶的研究一直很活跃。
1960年Mandl等从牙周病患者的送检样品中首次分离出产胞外弹性蛋白酶的微生物Flavobaterium clastdyticum，并从它的培养液中分离纯化出专一降解弹性蛋白的菌源性弹性蛋白酶。此后从细菌、霉菌、放线菌中相继分离出产酶菌株及其菌源弹性蛋白酶，但初期主要集中于医学微生物病原学的研究。70年代中期以来，日本和前苏联学者对微生物发酵生产弹性蛋白酶进行了大量的研究，并申报了许多专利菌种。其中研究比较详尽的是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa IFO3455)。另外，1974年，Shiio等从自然界取样分离的Flavobacterium immotum 9-35具有很强的弹性蛋白酶分泌能力。后来分离出1株利福平抗性的高产突变株Flavobacterium R-102-87，在以葡萄糖、干酪素为营养源的发酵培养基中，30 ℃振荡培养24 h，酶产量达145U/mL(40 ℃，20 min，使1.0 mg地衣红-弹性蛋白质完全溶解的酶量为1U)。
前苏联学者对放线菌属和曲霉属菌株产弹性蛋白酶研究较多。放线菌属产弹性蛋白酶的代表菌株是Actinomyces rimosus和Actinomyces fradiae119。将Actinomyces rimosus所产的酶纯化并与胰弹性酶比较，发现除相对分子质量较大外，其它性质及水解专一性都与胰源酶十分相似。
真菌中产弹性蛋白酶的高产菌株是曲霉属，前苏联Parksrskyte等选出的弹性蛋白酶高产菌Aspergillus versicolor 837，在以硫酸铵为氮源的马铃薯汁培养基深层液体培养48 h，然后强烈通风培养4 d，培养液积聚大量胞外弹性蛋白酶。
我国对微生物产弹性蛋白酶的研究则少见文献报道，直到上世纪90年代才有颜子颖等[5]关于芳香黄杆菌产弹性蛋白酶菌种筛选、发酵条件研究及酶分离纯化等方面的报道。他们分离的黄杆菌Flavobacterium sp.17-87在30℃，摇瓶培养24 h，弹性蛋白酶产量达120 U/mL，并从中成功地分离出了黄杆菌弹性蛋白酶结晶。
随后，曹军等[6]从不同省区采集的500多个土样中分离得到多株产弹性蛋白酶菌株，主要集中在黄杆菌属和色杆菌属中。经细胞工程技术处理后，黄杆菌属中F-122菌摇瓶发酵产酶能力达到240 U/mL，活力比原始菌株提高了58%。
陈启和等[7]从土壤中也筛选到一株高产弹性蛋白酶的芽孢杆菌(EL3)，其酶活达100 U/mL。经过诱变选育、培养基优化等系列研究，获得了大幅度提高酶活性的培养条件。陈丽娟等[8]对枯草芽孢杆菌产弹性酶及提纯工艺进行了较为深入的研究。王娟丽等[9]从土壤中筛选了一株弹性蛋白酶高产菌株Bacillus pseudofirmus EL112，酶活性也达100 U/mL。据hiio等报道，产酶活性达155 U/mL，具备了工业化生产价值。
2微生物产弹性蛋白酶的特征
微生物产生的弹性蛋白酶在结构特征上，具有2个标志性特征：(1)与弹性蛋白质有高亲和力；(2)酶切位点在脂肪族氨基酸羧基参与形成的肽键上。虽然不同来源的弹性蛋白酶的特点、性质、相对分子质量不尽相同，但迄今为止所有分离的弹性蛋白酶最适作用pH均在7.0以上，属于碱性弹性蛋白酶，酸性弹性蛋白酶尚未见报道。与其它的碱性蛋白酶不同，碱性弹性蛋白酶对甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)残基有很高的水解特异性。弹性蛋白中Ala、Gly含量高达55%。这也解释了弹性蛋白酶能高效降解弹性蛋白质的原因。
弹性蛋白酶的水解机制，是首先使弹性蛋白质的结构变疏松并溶解，然后将已溶解的弹性蛋白质降解成可溶的多肽及氨基酸。弹性蛋白质在碱性环境下易变性，结构疏松，有利于弹性蛋白酶对其水解。从嗜碱菌中筛选得到的菌株所产弹性蛋白酶有较高的最适反应pH ......
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