核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用
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摘要：多糖由于结构复杂使解析结构非常繁琐和困难，使对各种多糖的深入研究受限。核磁共振波谱法(NMR) 是解析物质结构最有效的手段，近年该技术的发展也很迅速。本文综述了一维核磁共振(1D-NMR)和二维核磁共振波谱法(2D-NMR，包括COSY，TOCSY，ROESY，NOESY， HMQC，HSQC与HMBC)在多糖结构分析中的应用。这些技术可以提供如多糖的单糖组成、单糖残基间的顺序、单糖残基在糖苷键中的位置、环状结构的类型和糖苷键的构型等许多信息，成为分析多糖结构不可缺少的工具。
关键词：核磁共振波谱法；多糖；结构分析
中图分类号：Q532文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0039-05
多糖是生物体内普遍存在的一类生物大分子，糖结合物在细胞识别、细胞间物质运输和调节免疫功能等方面具有重要的功能。目前已从多种生物体中提取了多种活性多糖，发现它具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等作用。因此，多糖的研究引起了越来越多的重视[1,2]。
结构是多糖活性的基础，多糖一级结构的研究包括单糖残基的种类和顺序，多糖残基在糖苷键中的位置，环状结构的类型和糖苷键的构型。而组成多糖的单糖品种繁多，单糖的连接顺序、连接位置的不同以及是否存在侧链使多糖结构更具复杂性，其结构鉴定也更困难。目前常用的多糖结构分析方法主要分为化学分析法、生物学分析法和物理分析法3大类，其中物理分析法包括核磁共振波谱(NMR)、红外光谱、质谱、X-射线衍射光谱等。现将近年来核磁共振波谱在多糖结构分析中的应用进展作一综述。
1一维核磁共振
NMR检测组成有机化合物分子的原子核性质及其与周围化学环境的相互作用，一维核磁共振氢谱(1H-NMR)和一维核磁共振碳谱(13C-NMR)可为多糖的结构分析提供有用的信息。
1.11H-NMR
多糖上的羟基信号峰较宽，化学位移值(δ)可变，干扰其它氢信号，所以常通过重水交换除去。糖环碳上大部分质子的化学位移由于受羟基的屏蔽作用而位于3~4 ppm范围内，信号重叠严重，解析困难。但异头氢质子H-1的化学位移处于较低场，在4.5~5.5 ppm，一般情况下，此区域内有几个质子信号，表示有几种单糖种类；α型吡喃糖H-1质子化学位移大于4.95 ppm，β型吡喃糖H-1质子化学位移小于4.95 ppm，借此可以判断糖环的构型。如Jia等[3]从猴头菇中得到一杂多糖，1H-NMR中有3个异头氢信号，δ4.50 ppm、δ4.95 ppm和δ5.05 ppm，提示由3种单糖组成，结合化学分析和文献，分别为D-葡萄糖(β构型)、D-半乳糖(α构型)和L-鼠李糖(α构型)。糖环的构型也可由异头质子与邻位质子的偶合常数(J)来推断，异头质子与邻位质子处于垂直键-平伏键或平伏键-平伏键方向时，J为1~4 Hz，处于垂直键-垂直键方向时，J为6~10 Hz。如从真菌Termitomyces eurhizus的子实体中得到的葡聚糖PS-Ⅰ，1H-NMR中异头质子与邻位质子的J为3 Hz，表明其葡萄糖残基均为α构型[4]。解析图谱时一般先找出容易辨认的质子信号，如异头质子，再通过相同偶合常数的信号来确定其邻位质子。
1.213C-NMR
13C-NMR的化学位移范围较1H-NMR广，达300 ppm，具有较好的分辨率，并且许多文献中有单糖、寡糖和多糖的碳谱数据[5]，可用于对比确定各种碳的化学位移。和1H-NMR一样，糖的异头碳位于较低场，δ95~110 ppm，此范围内有几个信号，表示有几种单糖组成。需要注意的是，同一种单糖在多糖中的位置不同，可能会导致异头碳不同的化学位移，一般比较接近，几乎重叠[6]。取代基不同的空间排列对化学位移有较大的影响，异头碳上取代基为垂直键比为平伏键的化学位移处于较高场，据此可以判断糖环的构型，如D-葡萄糖，α型δ97~101 ppm，β型δ103~106 ppm[7]。另可根据苷化位移规则，即糖上羟基被其它基团取代后其相连羟基碳的化学位移向低场移动，确定多糖残基中的取代位置和分枝点的位置。
Jansson等[8]设计的计算机程序CASPER，用于测定具有有序重复单元的多糖结构。该程序利用多糖的13C-NMR及单糖和甲基化分析的信息，基于重复单元中单糖的特性和不同连接位置的差异，构建出所有可能的排序。借助从二糖获得的13C-NMR化学位移数据，模拟出可供选择的结构波谱，从中筛选出与所测未知多糖波谱最一致的结构。该程序验证了2个已知多糖，均得到了正确的结构。后来发展的CASPER扩展版本，利用1H-NMR及2D-NMR的信息，可以测定具有分枝的复杂多糖的结构。验证了4个已知多糖，有3个多糖的结构被正确推导出，第4个多糖测定出与NMR相一致的有2个，其中有一个是正确的结构。该程序在后来的多糖结构分析中也得到了应用[9]。
2二维核磁共振(2D-NMR)
2D-NMR是有两个时间变量，经两次傅里叶变换得到两个独立的频率变量的谱图。多糖中相同原子的化学环境差别不大，信号重叠严重，利用2D-NMR技术，可以使难以辨认的信号得到确认，并可得到多糖分子的构型及构象方面的信息。
2.1COSY
COSY(correlation spectroscopy，相关能谱法)包括H,H-COSY和C,H-COSY。H,H-COSY提供的是分子中氢原子与氢原子间通过化学键的偶合关系，包括质子间孪生(2JHH)、邻位(3JHH)或远程如烯丙位和W形( 4JHH)的偶合，一般没有质子间的空间偶合关系。偶合常数越大，偶合峰越强。通过糖上质子间的偶合关系，可从容易辨认的质子(如异头质子或甲基质子)开始，寻找糖上其它碳位的质子。来源于Angelica sinensis (Oliv.) Diels [10]的a-D-(1→6)-葡聚糖，由H,H-COSY归属了每个质子信号。Kilcoyne等[11]从Pseudoalteromonas rubra ATCC 29570中得到一个复杂的多糖，采用二维COSY，使每个质子的信号得到了确认。
C,H-COSY是1H和13C核之间的位移相关谱，它将直接相连的1H和13C核关联起来。揭示出哪个H原子连接于哪个C原子，一个C原子上连接几个H原子。由于13C-NMR信号具有比1H-NMR信号化学位移散布宽的特点，一些在1H-NMR中十分拥挤区域中的质子信号在C,H-COSY中随化学位移分布极宽的13C-NMR信号而散开 ......
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